玉米鈣依賴蛋白激酶38(ZmCDPK38)的生物信息學及表達特性分析

李建平，足木熱木·吐爾遜，常曉春，郝曉燕，陳 果，高升旗，孫良斌，黃全生

(新疆農業科學院核技術生物技術研究所/新疆農作物生物技術重點實驗室，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】玉米等高等植物在長期的進化過程中形成一系列生理或發育機制來響應環境中的各種脅迫[1]。這些生理或發育機制在生化水平上涉及許多重要的生化代謝途徑的調節；在分子水平上涉及包括逆境脅迫信號的傳遞與基因轉錄控制等一系列過程[2]。但是，植物應對逆境脅迫的調控機制是異常復雜的[3]。利用分子生物學方法和手段探索作物的耐旱機制，改善作物本身的抗旱能力，進而發現新的遺傳資源成為培育耐旱新品種的重要環節?！厩叭搜芯窟M展】1982年Hetherington等首次在豌豆(Pisumsativum)中發現1個CDPKs[4]。隨后在植物、原生動物中相繼發現了CDPKs的存在[5]。在擬南芥(Arabidopisthaliana)中目前已發現34個CDPKs[6]，水稻中有31個成員[7]，玉米(Zeamays)中有40個CDPKs[8]。除此之外，在其它植物中，例如：馬鈴薯[9](Solanum)、番茄[10](Lycopersiconesculuentum)、小麥[11](Triticumaestivum)和棉花[12](Gossypiumraimondii)中也相繼發現了CDPKs家族。在玉米中，目前已發現40個玉米鈣依賴蛋白激酶(ZmCDPK)，其中ZmCDPK1、ZmCDPK7、ZmCDPK9、ZmCDPK10、ZmCDPK11、ZmCDPK22、ZmCDPK28和ZmCDPK34等基因相繼被克隆，并且研究發現這些CDPKs基因在接收鹽、ABA和H2O2等脅迫信號后轉錄水平上調[13]。玉米CDPK基因可能參與玉米生物非生物脅迫信號途徑，但是其功能及信號傳導機制目前尚不清晰，還有待深入研究。【本研究切入點】部分ZmCDPK基因成員如ZmCDPK38目前尚未見相關研究報道，是否響應非生物脅迫及其在非生物脅迫中發揮什么樣的功能有待發掘和研究?！緮M解決的關鍵問題】研究以ZmCDPK38作為研究對象，從生物信息學角度和基因表達特性2個方面對該基因的功能進行判斷，為研究該基因的功能提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

玉米自交系B73種子由中國農科院作物科學研究所王國英課題組提供。

Trizol總RNA提取試劑購自Invitrogene公司；第一鏈cDNA合成試劑盒購自全式金生物科技有限公司。Real-time PCR試劑盒購置ABI公司，其它普通化學試劑均為國產。

1.2 方 法

1.2.1 ZmCDPK38的序列比對及聚類遺傳分析

ZmCDPK38的氨基酸序列多重比對分析通過在線軟件Multalin(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)進行。系統進化分析基于NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫與MEGAX軟件的ClustalW功能，采用NJ算法構建的系統進化樹，Boot Strap參數設為500，其他參數設為默認值。

1.2.2 ZmCDPK38氨基酸結構域及Motif保守序列

ZmCDPK38氨基酸結構域分析基于NCBI蛋白結構CCD在線工具進行。利用MEME(http://meme-suite.org/)在線軟件分析玉米CDPK家族結構域保守序列。

1.2.3 基因表達

1.2.3.1ZmCDPK38基因在玉米不同組織中的表達分析：分別提取玉米的根、莖、葉、雄穗和雌穗的總RNA并反轉錄合成cDNA。

1.2.3.2ZmCDPK38基因在不同非生物脅迫條件下的表達分析：花盆中16 h光照/8 h黑暗下生長的玉米幼苗待長至三葉期時進行脅迫處理：(1)溫度脅迫：幼苗分別移至4和42℃處理，正常條件下生長的幼苗作為對照，在不同處理時間段整株采樣，每次取樣5株，生物學重復3次；(2)鹽脅迫：三葉期幼苗從花盆中取出，洗去根部殘留培養基質并盡量避免傷根，將幼苗于Hoagland營養液中水培3 d后移至含250 mM NaCl的Hoagland營養液中培養，于不同時間段取樣，每次取樣5株，生物學重復3次；(3)干旱處理：三葉期幼苗從花盆中取出，洗去根部殘留培養基質并盡量避免傷根，將幼苗于Hoagland營養液中水培3 d后移至含10%PEG6000的Hoagland營養液中培養，于不同時間段取樣，每次取樣5株，生物學重復3次。所有樣品經提取總RNA及反轉錄后，通過實時熒光定量PCR分析在不同非生物脅迫條件下ZmCDPK38基因的表達情況。

2 結果與分析

2.1 ZmCDPK38的蛋白序列比對及遺傳進化

研究表明，玉米ZmCDPK38基因編碼區長度為1 719 bp，編碼512個氨基酸。該氨基酸序列在NCBI進行blast后發現擬南芥CDPK28(AtCDPK28)、擬南芥CDPK18(AtCDPK18)、大豆CDPK28(GmCDPK28)、玉米CDPK28(ZmCDPK28)、高粱CDPK18(SbCDPK18)、辣椒CDPK16(CbCDPK16)及煙草CDPK28 (NtCDPK28)與其序列同源性較高，ZmCDPK38與其它7個CDPK的序列相對較為保守，均具有典型的蛋白激酶區域。蛋白激酶活性調控區域由20～30個氨基酸殘基組成，富含堿性氨基酸。遺傳進化及序列一致性分析結果顯示，ZmCDPK38除了與ZmCDPK28親緣關系較近，序列一致性高達90.43%，與高粱SbCDPK18的親緣關系同樣較近，序列一致性為87.28%。與其它物種的CDPK氨基酸序列一致性依次為GmCDPK28(82.30%)、AtCDPK18(80.84%)、CbCDPK16(79.68%)、AtCDPK28(78.83%)及NtCDPK28(73.23%)。圖1，圖2

2.2 ZmCDPK38的蛋白結構域

研究表明，ZmCDPK38包含CDPKs家族典型的4個蛋白結構域即N-端可變域、蛋白激酶域、自抑制域和類鈣調素結合域。其中，在類鈣調素結合域中含有2個EF hands, 在蛋白激酶域包含Ser/Thr蛋白激酶結構域。圖3

研究表明，3個Motif氨基酸的保守序列分別為：Motif1(VDFEEFVAATLHVHQLVEHDTEKWKSLSQ)Motif2(VRQMLKVAAECHLHGLVHRDMKPENFLFK)Motif3(VKREVKILKALQGHENVVHFY NAFEDDNY)，在8個CDPK中具有高度保守性。圖4

2.3 ZmCDPK38在不同組織中的表達模式

研究表明，該基因在所有組織中均有表達，但轉錄水平存在顯著差異，其中該基因在葉片中的表達高于其它組織，其次是在莖部；在根、雌穗和雄穗的表達水平顯著低于其它組織，根中的轉錄水平略高于雌穗和雄穗。圖5

2.4 ZmCDPK38基因在不同非生物脅迫條件下的表達

研究表明，ZmCDPK38在高溫條件下的轉錄水平未發生較明顯的變化，在高溫處理24 h后表達水平下調明顯，故該基因并未受高溫脅迫誘導表達。鹽脅迫條件下，隨著脅迫時間的延長，ZmCDPK38的轉錄受到誘導表達上調，在處理3 h后達到峰值，轉錄水平是對照的3.2倍。盡管隨著脅迫時間的延長表達量有所下降，但是表達水平仍高于對照，因此，可以初步判斷該基因的表達受鹽脅迫誘導。另外在干旱脅迫條件下，ZmCDPK38的轉錄水平隨著脅迫時間的延長不斷上調，并且在脅迫6 h后表達量達對照的9.5倍，該基因的表達受到干旱脅迫的誘導。圖6

3 討 論

玉米等植物為適應各種外界環境刺激形成了復雜的逆境脅迫信號傳導機制，其中Ca2+被認為作為植物特有的第二信使主要參與植物非生物脅迫信號的傳導，Ca2+通過鈣結合蛋白介導將脅迫信號傳遞到調控通路的下游，鈣依賴蛋白激酶(CDPK)作為鈣結合蛋白之一在植物抵抗逆境脅迫的調控反應中發揮著重要作用[14]。從玉米中分離得到了ZmCDPK38基因，利用生物信息學方法對該基因分析后發現它與其它6個物種的CDPK家族成員在氨基酸序列和蛋白結構上存在較大的相似性，具有CDPK家族典型的類鈣調素結合域，這也是CDPKs和其他類型蛋白激酶存在區別的區域[15]。ZmCDPK38基因的表達具有組織特異性，這一表達特性也存在與其它物種中的CDPKs，例如小麥TaCDPK13基因在葉、幼穗以及未成熟的種子中表達，而在根、莖中則未見表達[11]；擬南芥AtCPK17和AtCPK34基因主要在花粉管形成期表達，并參與調控花粉管的生長[16]；水稻OsCDPK6基因在花粉管形成階段轉錄水平上調[17]。研究表明，當植物受到生物脅迫或非生物脅迫時，CDPKs基因的轉錄水平發生改變，并且不同CDPK基因分別對不同脅迫產生應答。例如擬南芥受鹽和干旱脅迫后，AtCDPK1和AtCDPK2基因表達上調，而在低溫脅迫下，其基因表達均沒有顯著變化；AtCDPK4 和AtCDPK11基因受ABA誘導表達，正向調節ABA介導的信號途徑，而AtCPK12基因在ABA信號途徑中則作為負向調控因子[18]。水稻OsCDPK7基因在冷、鹽、干旱脅迫條件下的表達發生改變，水稻耐低溫、鹽和干旱脅迫的程度與OsCDPK7基因的表達水平有密切關系[19]。ZmCDPK38同樣對不同的非生物脅迫產生一定的應答反應，在研究中，ZmCDPK38主要響應干旱和鹽脅迫，但在高溫和低溫脅迫下表達沒有顯著變化，暗示該基因在玉米應對干旱和高鹽脅迫的反應中扮演一定的角色。但是，ZmCDPK38基因是否在玉米中發揮耐旱和耐鹽具備實際功能有待深入研究。

4 結 論

ZmCDPK38與ZmCDPK28及高粱等6個其它植物物種的CDPK的氨基酸序列具有較高的一致性，遺傳進化關系上較近。氨基酸序列包含4個結構域，具有CDPKs家族氨基酸的典型特征，Ser/Thr蛋白激酶結構域相對保守。ZmCDPK38基因雖然在玉米的不同組織均有表達，但是表達水平具有組織特異性，在葉片的表達水平高于根、莖、雄蕊和雌蕊。在不同非生物脅迫下，ZmCDPK38基因的表達差異顯著，其表達受干旱及鹽脅迫誘導，而不受低溫和高溫的誘導。