辛伐他汀對慢性阻塞性肺疾病模型大鼠炎性因子表達的影響*

劉 青，孫伯堅，任冬飛，李 林，楊智暉，梁瑞凱

（1.河北省老年病醫院，河北 石家莊050021；2.河北醫科大學第一醫院，河北 石家莊050000）

慢性阻塞性肺疾?。–OPD）是臨床常見的以氣流受限為主要特征的慢性呼吸系統疾病，且病情呈進行性發展，發病率及致死率均較高［1-2］。目前，臨床認為COPD發病基礎為氣道慢性炎癥，主要累及氣道和肺實質，炎性細胞在氣道內的浸潤會促進氣道內黏液分泌，加重炎性反應，造成氣道惡性循環，故炎性細胞及其細胞因子在COPD發病過程中扮演重要角色［3-4］。炎性因子包括白細胞介素（IL）家族大部分成員、腫瘤壞死因子（TNF）家族成員及基質金屬蛋白等，其中白細胞介素17（IL-17）、白細胞介素22（IL-22）均參與COPD發病過程，故有效阻斷IL-17，IL-22等炎性因子的釋放對于減輕炎性反應尤為關鍵［5-6］。目前，臨床對COPD的治療多以減輕癥狀、預防感染、抑制病情繼續惡化為主，出現重度及極重度氣流受限癥狀的患者常使用糖皮質激素類藥物，以減輕氣道炎性程度，但長期服用易出現藥品不良反應，不利于康復［7-8］。近年來相關研究發現，他汀類藥物在COPD的預防及治療中具有廣闊前景，但具體抗炎機制及藥理作用尚不清楚［9］。本研究中觀察了辛伐他汀對COPD模型大鼠IL-17和IL-22表達的影響。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動物

1.1.1 儀器

CX32RTSF型顯微鏡（日本Olympus公司）；RM2235型石蠟切片機、EG1160型石蠟包埋機（德國Leica公司）；MLS-3750型全自動高壓蒸汽鍋（日本Sanyo公司）；BI-2000型醫學圖像分析系統（成都泰盟科技有限公司）；LHP-400B型培養箱（江蘇省金壇市雙捷實驗儀器廠）。

1.1.2 試藥

辛伐他汀（北大醫藥股份有限公司，批號為20193359，規格為每片20 mg）；10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司，批號為20141001）；脂多糖（LPS，美國Sigma公司，批號為L2880）；視黃酸相關孤兒受體γt（RORγt，上海研卉生物科技有限公司，批號為ab219496）；香煙（滁州煙卷廠，規格為每支含尼古丁1.2 mg、焦油19 mg）；其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.1.3 動物

清潔級SD大鼠50只，雄性，體質量0.18～0.22 kg，周齡6～8周，購自河北醫科大學動物管理中心［實驗動物許可證號SCXK（冀）2013-1-003］。標準條件飼養7 d，自由進食、飲水，適宜溫度、濕度，人工黑暗和光照交替。

1.2 方法

1.2.1 模型建立

分別于第29，43天以水合氯醛（0.5 mg/100 g）麻醉大鼠，然后向氣管內注入LPS 200μg；每日上午將大鼠放于密封的1 m3煙室內，持續放入香煙煙霧，確保大鼠持續吸煙30 min，每日1次，每次15支，復制模型共用時56 d。建模成功標準：大鼠行動靈敏度及活動力均下降，進食量減少，毛發逐漸失去光澤，出現干澀枯黃，對外界刺激的敏感度下降，體質量明顯減輕；病理學改變，開胸可見肺臟萎陷，肺臟體積明顯增大，呈灰暗色；蘇木精-伊紅（HE）染色見典型肺氣腫表現。

1.2.2 分組與給藥

將50只大鼠隨機分為空白對照組（等體積生理鹽水）、模型組（等體積生理鹽水）和辛伐他汀高、中、低劑量組（15，10，5 mg/kg），灌胃給藥，每日1次，連續灌胃8周（除煙熏日外）。

1.2.3 免疫組化檢測

腹腔注射10%水合氯醛（0.5 mg/100 g）麻醉大鼠，開胸后心臟放血處死大鼠［10］。2葉右肺標本離體后用10%甲醛溶液固定24 h，脫水、石蠟包埋、切片。以HE染色，置顯微鏡下、選取6個視野觀察，分析白細胞介素17（IL-17）、白細胞介素22（IL-22）及RORγt表達水平。細胞胞漿內呈棕黃色顆粒即為陽性表達，顏色與表達呈正比，棕黃色顆粒越多即表達水平越強；細胞胞漿內未出現棕黃色顆粒即為陰性。

1.2.4 炎性因子表達水平檢測

取上述切片，置顯微鏡下，以圖像分析軟件分析支氣管黏膜上皮細胞陽性細胞百分數。選取內徑＜2 mm的小氣道，統計出氣道間隔陽性細胞數，以每1 m3陽性細胞數表示。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 對大鼠肺組織切片炎性因子表達的影響

結果見圖1（因篇幅所限，僅選取辛伐他汀高劑量組作為代表）。

2.2 對大鼠氣道間隔炎性因子陽性細胞數的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠氣道間隔IL-17，IL-22，RORγt陽性細胞數顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀高、中劑量組大鼠氣道間隔IL-17，IL-22，RORγt陽性細胞數顯著減少（P＜0.05）。詳見表1。

2.3 對大鼠支氣管黏膜上皮組織炎性因子陽性細胞數的影響

與空白對照組比較，模型組大鼠支氣管黏膜上皮組織IL-17，IL-22，RORγt陽性細胞數顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，辛伐他汀高、中劑量組大鼠支氣管黏膜上皮組織IL-17，IL-22，RORγt陽性細胞數顯著減少（P＜0.05）。詳見表2。

3 討論

COPD作為臨床常見病及多發病，發病機制較復雜，且目前臨床針對該疾病的基礎研究及防治均無關鍵性突破［11-12］。COPD動物模型應具備慢性氣道阻塞、小氣道受阻增大及肺順應性降低、與COPD相似的誘因、出現氣道重塑及氣道高反應性等特征［13-14］。目前，臨床認為齒類動物可作為建模的最佳動物，其基因測序與人類極為相似；且其價格低廉，繁殖周期較快［15］。本研究中實施吸煙加氣道內注射內毒素多因素誘導方案，香煙中含有甘油的尼古丁及氫氰酸等有毒物質可破壞氣管纖毛上皮細胞，導致上皮細胞組織出現損傷或壞死，且氣道及肺組織在煙霧作用下，通透性增加，易被蛋白酶攻擊，損傷肺組織，最終誘發COPD［16-17］。

圖1 免疫組化圖（HE，×400）A.IL-17 B.IL-22 C.RORγtA1，B1，C1.Blank control group A2，B2，C2.Model group A3，B3，C3.Simvastatin high-dose groupFig.1 Immunohistochemical image（HE staining，×400）

表1 各組大鼠氣道間隔炎性因子陽性細胞數比較（±s，%，n＝10）Tab.1 Comparison of the positive cells of inflammatory factors in airway septum of rats among the five groups（±s，%，n＝10）

表1 各組大鼠氣道間隔炎性因子陽性細胞數比較（±s，%，n＝10）Tab.1 Comparison of the positive cells of inflammatory factors in airway septum of rats among the five groups（±s，%，n＝10）

注：與空白對照組比較，a P＜0.05；與模型組比較，b P＜0.05。表2同。Note：Compared with those in the blank control group，a P＜0.05；compared with those in the model group，bP＜0.05；as well as Tab.2.

組別空白對照組模型組辛伐他汀 低劑量組中劑量組高劑量組IL-17 5.34±3.25 95.34±15.34a 85.64±13.24 76.35±11.28b 65.84±8.64b IL-22 8.64±3.15 64.98±9.68a 58.61±7.16 52.61±6.34b 38.64±4.02b RORγt 6.82±4.34 77.68±12.34a 71.64±10.36 62.13±8.24b 54.36±6.87b

表2 各組大鼠支氣管黏膜上皮組織炎性因子陽性細胞數比較（±s，%，n＝10）Tab.2 Comparison of the positive cells of inflammatory factors in the bronchial epithelial tissue of rats among the five groups（±s，%，n＝10）

表2 各組大鼠支氣管黏膜上皮組織炎性因子陽性細胞數比較（±s，%，n＝10）Tab.2 Comparison of the positive cells of inflammatory factors in the bronchial epithelial tissue of rats among the five groups（±s，%，n＝10）

組別空白對照組模型組辛伐他汀 低劑量組中劑量組高劑量組IL-17 8.57±4.72 78.68±10.98a 70.15±8.34 65.34±6.25b 58.64±4.21b IL-22 6.28±5.04 58.97±9.35a 51.31±8.25 46.35±7.02b 38.64±4.25b RORγt 7.58±3.57 79.46±11.24a 71.54±10.64 65.34±9.15b 52.31±7.21b

IL-17主要來源于CD4＋T淋巴的Th17細胞，通過特異性轉錄因子RORγt編碼產生的效應因子，促進中性粒細胞及巨噬細胞的聚集及基質金屬蛋白酶-9的分泌［18-19］。此外，IL-17還可促進支氣管上皮細胞中氣道黏液蛋白的產生，增強氣道炎性反應，參與疾病發生與發展［20-22］。IL-22主要由Th17細胞及自然殺傷（NK）細胞產生，可誘導中性粒細胞的分泌，加重氣道炎癥程度，加快COPD進程［23］。他汀類藥物是3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，主要在肝臟內合成，臨床常用于血管疾病并發癥預防及調脂治療［24］。相關研究表明，他汀類藥物可發揮抗炎、抗氧化及抑制黏附分子表達等作用［25］。本研究中，與模型組比較，辛伐他汀高、中劑量組大鼠氣道間隔和支氣管黏膜上皮組織IL-17，IL-22，RORγt陽性細胞數顯著減少。辛伐他汀抑制氣道及肺組織中性粒細胞滲出及炎性因子的釋放，減輕全身炎性反應，破壞炎性細胞包膜上抑制蛋白及脂筏結構的異戊二烯化修飾，繼而起到抗炎作用。本研究仍有一定局限性，如未針對不同劑量辛伐他汀用于COPD模型大鼠的不良反應進行研究，今后需進一步增加對不同劑量辛伐他汀治療COPD安全性問題的分析。

綜上所述，辛伐他汀可有效減弱COPD模型大鼠炎性因子的表達，減輕氣道及肺部炎性反應。