響應面法優化百合蜂蜜復合醋醋酸發酵工藝條件

徐貴靜，王新本，賈孝榮

（蘭州古馳生物科技有限公司，甘肅蘭州 730050）

百合（Lilium browniivar.viridulum Baker）是百合科百合屬多年生草本球根植物，又名強蜀、山丹、中逢花、百合蒜等[1-2]。百合不僅含有豐富的營養成分，還具有多種功能性成分，如總磷脂、多糖、粗纖維、酚類等[3-5]，是國家衛計委公布的首批藥食同源植物之一。研究表明，百合具有抗癌、抗氧化、抗過敏、調節免疫、降血糖、止咳平喘等保健功能[6-8]。而蜂蜜含有大量的糖類、維生素、礦物質和氨基酸[9-10]，其單糖可被人體直接吸收，對婦女、幼兒，特別是老人具有良好的保健作用。研究表明，蜂蜜可改善血液成分，促進心腦血管功能；促使肝細胞再生，抑制脂肪肝的形成；增強抵抗力，促進睡眠和胃腸蠕動等[11-12]。

傳統食醋是以高粱、大米等富含淀粉的作物為原料，在微生物作用下，經酒精發酵、醋酸發酵及后熟、陳釀等工藝釀造而成的一種酸性調味品。除了含有大量的醋酸外，醋還含有鈣、鐵、乳酸、甘油及脂肪酸等物質，研究表明經常食用醋可促進脂肪和糖類物質的代謝，利尿通便，還可降低血壓和血清膽固醇[13]。但是隨著生活水平的提高，人們對醋的需求不再局限于傳統風味，而是有了更多特色風味的需求[14-16]。目前百合類醋只有百合與苦蕎、南瓜及杜仲發酵釀造的醋[17-19]，尚未見百合與蜂蜜共同發酵釀造醋的研究。因此本研究以鮮百合、蜂蜜為原料，應用響應面法優化了百合蜂蜜復合醋醋酸發酵工藝參數，為百合蜂蜜復合醋的生產提供理論支持和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

蘭州百合，2019年11月采摘，蘭州市售。

醋酸菌C1，實驗室分離；蜂蜜，市售；食品級α-淀粉酶（2 000 U/g），邢臺萬達生物工程有限公司；食品級糖化酶（50 000 U/g），江蘇博立生物制品有限公司。

1.2 儀器與設備

UV-1800PC紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；GL-21M高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；Mettler Toledo AL204分析天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；搖床，中科院武漢科學儀器廠；離心機，上海醫用分析儀器廠；恒溫水浴箱，北京醫療設備廠；磁力攪拌器，上海南匯電訊器材廠。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

百合預處理→混合蜂蜜→配料→滅菌→接種→酒精發酵→醋酸發酵→滅菌→陳釀→澄清→灌裝→成品

1.3.2 操作要點

（1）百合預處理

鮮百合清洗去除泥沙等雜物，并去除腐爛、褐變的百合，打漿后待用（打漿時加入1‰抗壞血酸，防止褐變）。由于鮮百合含有大量的淀粉，容易產生沉淀且會影響飲料的口感，因此，必須將之降解，本試驗選用反應條件較為溫和的生物酶降解工藝，盡可能地保留百合原有的營養成分及自然風味[20]。采用先液化后糖化的工藝，液化溫度70～88 ℃，α-淀粉酶添加量為12 U/g；糖化溫度58～62 ℃，糖化酶添加量為200 U/g。

（2）酒精發酵

將蜂蜜、百合處理液及水按照一定的比例混合，加入活化后的酵母（添加量1%），發酵溫度為28～38 ℃，發酵一段時間后得到發酵底液；酒精發酵初期酵母菌大量繁殖，需要通入少量空氣，中后期進行酒精發酵，為無氧發酵，并在發酵過程中控制發酵溫度及排除所產生的CO2氣體[21-22]。

（3）醋酸發酵及陳釀

酒精發酵結束后，將醋酸菌種擴大培養液接入酒精發酵醪中發酵，發酵溫度28～38 ℃，發酵一段時間后滅菌，于4～10 ℃條件下陳釀30 d[23-25]。

（4）澄清

加入1‰皂土于4 ℃澄清12 h，上清液進行滅菌。皂土在使用前必須活化，活化方法為皂土與水按照質量比1∶10混勻，混勻后靜置24～48 h[26-27]。

1.3.3 百合和蜂蜜配比的確定

將百合和蜂蜜分別按照比例2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4添加，按照1.3.1的工藝流程釀造百合蜂蜜復合醋，以感官評分（外觀20%、香氣20%、口味40%和風格20%）作為評價指標，由25名專業人士對百合蜂蜜醋的感觀進行評價。

1.3.4 百合蜂蜜復合醋醋酸發酵工藝單因素試驗

分別考察初始酒精度、接種量、發酵溫度及發酵時間4個因素對百合蜂蜜復合醋酸度的影響，初始酒精度設置為4°、6°、8°、10°、12°；接種量設置為3%、4%、5%、6%、7%；發酵溫度設置為28、30、32、34、36 ℃；發酵時間為4、6、8、10、12 d。

1.3.5 百合蜂蜜復合醋發酵工藝優化

為了更好地確定百合蜂蜜復合醋的最佳工藝參數，運用BOX-Behnken的中心組合設計試驗，選取初始酒精度（A）、接種量（B）、發酵溫度（C）和發酵時間（D）4個重要工藝參數為因素，以發酵結束后醋的酸度為評價指標，優化百合蜂蜜復合醋醋酸發酵工藝條件，響應面試驗因素與水平設計見表1。

表1 BOX-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of BOX-Behnken experiments design

1.4 酸度的測定方法

酸度的測定參照GB 2719—2018的方法。

1.5 數據分析

采用SPSS 21.0軟件進行均差等數據的分析，采用Office 2010軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 百合和蜂蜜配比的確定

圖1顯示了百合和蜂蜜的添加配比，由圖1可知，當百合和蜂蜜配比為1∶3時，百合蜂蜜復合醋的感官評分最高，因此，百合和蜂蜜配比確定為1∶3。

圖1 百合和蜂蜜添加配比的確定Fig.1 Determination of additive ratio of Lilium and honey

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 初始酒精度對百合蜂蜜復合醋酸度的影響

不同初始酒精度對百合蜂蜜復合醋酸度的影響結果見圖2。由圖2可知，隨著初始酒精度的升高，酸度呈現先升后降的趨勢，當初始酒精度為8°時，酸度最高，可達4.11%。分析認為初始酒精度低，醋酸菌轉化產生的醋酸含量低，而酒精度偏高則抑制了醋酸菌的生長，導致所產百合蜂蜜復合醋的酸度降低。因此，選擇初始酒精度為8°進行后續的響應面試驗。

圖2 初始酒精度對百合蜂蜜復合醋酸度的影響Fig.2 Effect of different alcohol of Lilium and honey compound vinegar

2.2.2 接種量對百合蜂蜜復合醋酸度的影響

不同接種量對百合蜂蜜復合醋酸度的影響見圖3。由圖可知，隨著接種量的升高，其酸度呈現先增后減的趨勢。適當增加醋酸菌接種量會縮短發酵周期，但是接種量過大會消耗發酵液中的酒精，同時產生過多的代謝產物，導致其細胞老化、自溶等，從而影響復合醋的產量。當接種量為6%時，復合醋的酸度最高。因此，接種量選擇6%進行后續的響應面試驗。

圖3 接種量對百合蜂蜜復合醋酸度的影響Fig.3 Effect of different inoculum size of Lilium and honey compound vinegar

2.2.3 發酵溫度對百合蜂蜜復合醋酸度的影響

發酵溫度對百合蜂蜜復合醋酸度的影響見圖4（見下頁）。由圖可知，隨著發酵溫度的增加，百合蜂蜜復合醋的酸度呈現先增加后降低的趨勢，發酵溫度為34 ℃時，酸度最高。發酵溫度過低，不利于醋酸菌的生長，而溫度過高，則會導致部分乙酸被氧化，加快醋酸菌的老化，造成百合蜂蜜復合醋的酸度低。因此選擇發酵溫度為34 ℃進行后續的響應面試驗。

圖4 發酵溫度對百合蜂蜜復合醋酸度的影響Fig.4 Effect of different fermentation temperature of Lilium and honey compound vinegar

2.2.4 發酵時間對百合蜂蜜復合醋酸度的影響

發酵時間對百合蜂蜜復合醋酸度的影響見圖5。由圖5可知，隨著醋酸發酵時間的增加，其酸度呈現先增后減的趨勢，當發酵10 d時，復合醋的感觀評分最高。隨著發酵的進行酸度逐漸增加，但由于過度發酵會導致部分乙酸被氧化。因此，選擇發酵時間為10 d進行后續的響應面試驗。

圖5 發酵時間對百合蜂蜜復合醋酸度的影響Fig.5 Effect of different fermentation time of Lilium and honey compound vinegar

2.3 響應面試驗結果及模型的建立

本研究根據百合蜂蜜復合醋的發酵工藝單因素試驗結果，最后選定初始酒精度、接種量、發酵溫度及發酵時間為優化試驗的四個因素，以酸度為響應值，利用Design-Expert 8.0.5b軟件進行4因素3水平Box-Behnken試驗設計，各因素水平見表1，試驗結果見表2，其二次多元回歸模型為：R=5.32+0.072A+0.053B+0.38C+0.12D+0.013AB-0.020AC+0.032AD-0.052BC+0.020BD-5.000×10-3CD-0.45A2-0.49B2-0.77C2-0.69D2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 The result and condition of response surface experiment

由回歸模型的方差分析（表3）可以看出：模型差異極顯著（P＜0.000 1），失擬項差異不顯著（P=0.054 0＞0.05），決定系數（R2）為0.984 4，校正系數（AdjR2）為0.968 9，該模型可以涵蓋該模型91.49%響應值的變化，因而擬合程度良好，試驗誤差小；且該回歸模型一次項、二次項及交互項中的A、C、D、BC、A2、B2、C2、D2均表現出顯著水平；各因素對產品酸度的影響依次為發酵溫度＞發酵時間＞初始酒精度＞接種量。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

圖6 初始酒精度、接種量、發酵溫度及發酵時間的交互作用對百合蜂蜜復合醋的影響Fig.6 Interaction of alcohol,inoculum size,fermentation temperature and fermentation time on Lilium and honey compound vinegar

初始酒精度（A）、接種量（B）、發酵溫度（C）和發酵時間（D）間的交互作用對產品總酸的影響如圖6所示。由圖可知，當初始酒精度一定時，隨著接種量的增大，百合蜂蜜復合醋的酸度呈現先增后減的趨勢。當接種量恒定時，隨著初始酒精度的增大，復合醋酸度呈現先增后減的趨勢，其它兩因素間的交互作用也均呈現先增大后緩慢降低的趨勢。

2.4 響應面工藝的驗證

通過響應面設計優化試驗分析，得出百合蜂蜜復合醋的最佳工藝條件為初始酒精度8.16°，接種量6.04%，發酵溫度34.5 ℃，發酵時間10.09 d，在此條件下預測發酵得到的百合蜂蜜復合醋酸度為5.38%。結合實際生產，將其修正為初始酒精度8.2°，接種量6%，發酵溫度34.5 ℃，發酵時間10 d，在此條件下進行驗證試驗，得到百合蜂蜜復合醋的酸度為5.42%，與預測值之間的相對誤差為0.74%，其參數具有一定的實用價值。

3 小結

對百合蜂蜜復合醋的發酵工藝進行響應面優化，確定了最佳工藝條件為初始酒精度8.2°，接種量6%，發酵溫度34.5 ℃，發酵時間10 d，在此條件下百合蜂蜜醋的酸度為5.42%，與預測值之間的相對誤差為0.74%。各因素對百合蜂蜜復合醋的影響大小依次為發酵溫度＞發酵時間＞初始酒精度＞接種量。通過對回歸模型的可靠性分析，得知該回歸模型極顯著，擬合度較好。因此，本試驗得到的參數具有一定的實用價值，所釀制的百合蜂蜜復合醋呈淡琥珀色，無沉淀物，酸味柔和，有醋香味及百合和蜂蜜的風味。