一株具有廣譜抗真菌活性的解淀粉芽孢桿菌的分離鑒定

劉小玉，付登強，劉立云，黃麗云，齊 蘭

（1.中國熱帶農業科學院椰子研究所，海南文昌 571339；2.海南省檳榔產業工程研究中心，海南文昌 571339）

近年來，化肥的施用顯著提高了作物產量，但為追求高產，盲目、過量施用化肥，造成了土壤肥力的嚴重流失，也導致部分地區植物土傳病害日益加重[1]。植物病蟲害防治過程中化學藥劑的大量使用會帶來環境污染、農藥殘留、植物病原菌產生抗藥性等諸多副作用，而生物防治可彌補化學防治的不足，逐漸成為病蟲害防治的發展趨勢[2-4]。

解淀粉芽孢桿菌具有廣泛抗菌能力，屬革蘭氏陽性菌，是目前研究較熱門的一類植物根際促生防病細菌。有研究表明，解淀粉芽孢桿菌通過產生植物生長激素IAA，分泌葡聚糖酶、幾丁質酶以及脂肽類抗菌活性物質，從而抑制植物病原菌，預防植物病害[5]。本文從油茶枯餅發酵液中分離篩選獲得菌株ck-05，通過平板對峙試驗研究了其對香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌、檳榔炭疽病菌、檳榔心腐病菌等11種植物病原菌的拮抗作用，并通過形態觀察、生理生化試驗及分子生物學技術等方法對菌株ck-05進行了鑒定，研究了其生物學特性，旨在為該菌株的推廣和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

油茶枯餅：中國熱帶農業科學院椰子研究所提供。

油茶枯餅∶水=1∶10（g/g）制成混合液，然后45 ℃發酵培養24 h制備茶枯發酵液，方法參考專利的方法[6]。

1.2 培養基

LB培養基：酵母粉5 g，NaCl 10 g，蛋白胨10 g，瓊脂18～20 g，水1 L，pH7.0～7.2。

PDA培養基：土豆200 g，葡萄糖20 g,瓊脂18～20 g，水1 L。

1.3 供試病原菌

檳榔炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、檳榔心腐病菌（Fusarium oxysporum）、椰子莖腐病菌（Ceratocystis paradoxa）、菜心炭疽病菌（Colletotrichum higginsianum）、油茶炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、油棕心腐病菌（Fusarium oxysporum）、椰子灰斑病菌（Pestalotiopsis pal marum）、板栗疫病菌（Cryphonectria para sitica）、香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp.Cubense4）、油茶葉斑病菌（Lasiodiplodia theobromae）、花生果腐病菌（Fusarium oxysporum），均由中國熱帶農業科學院椰子研究所實驗室提供。

1.4 方法

1.4.1 菌株ck-05的分離與純化

稱取10 g油茶餅粕發酵液，加入90 mL無菌水中，200 r/min震蕩培養30 min，搖勻后的樣品用無菌水稀釋10-1、10-2、10-3倍，分別取0.1 mL涂布于LB培養基上，45℃恒溫培養箱中培養48 h。挑取不同形態特征的單菌落進行分離與純化，將得到的純化菌株轉移至新的LB平板上，2 d后觀察菌落形態特征。將純培養的菌株轉入LB斜面，置于冰箱中保存備用。

1.4.2 拮抗活性的測定

采用平板對峙法[7]進行拮抗活性測定。直徑為5 mm的各病原菌菌餅分別接種在PDA平板中心，并將待測拮抗菌接種在距離中心25 mm的成正方形的4個點處，置于培養箱中28 ℃培養，以不接拮抗菌的PDA平板為對照，各處理設3次重復，待對照組病原菌長滿平板后，觀察并測量試驗組抑菌帶直徑，抑菌帶直徑越大，抑菌活性越強。

1.4.3 菌株ck-05形態學觀察及生理生化特性鑒定

將菌株ck-05接種在LB平板上，37 ℃培養2 d。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[8]對菌株的形狀、顏色、透明度等菌落形態特征及接觸酶試驗、甲基紅、V-P、硝酸鹽還原、淀粉水解、氧化酶、明膠液化等主要生理生化特征的試驗和觀察記錄。

1.4.4 菌株的分子學鑒定

采用細菌基因組DNA提取試劑盒提取目的菌株的DNA作為模板，通用引物27 F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和 1492R （5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行PCR擴增。取50 mL PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在紫外燈下觀察，并拍照保存。將PCR產物送至華大基因科技股份有限公司進行測序，并將序列通過在NCBI網站上進行Blast對比，采用BioEdit、Mega5.0等軟件對菌株進行系統發育分析[9]。

1.4.5 菌株ck-05的生物學特性研究

（1）制備種子培養液

將菌株ck-05接種至LB液體培養基中，在30 ℃、200 r/min搖床中震蕩培養48 h，用無菌水將濃度調至1×108cfu/L，即為種子培養液[9-10]。

（2）pH值對菌株ck-05生長的影響

配制LB液體培養基，用稀HCl和稀NaOH調節LB液體培養基的pH值，pH設為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0等8個梯度。分別將1 mL菌株ck-05種子培養液接種于50 mL不同pH的LB液體培養基中，于30 ℃、200 r/min搖床中震蕩培養48 h后測OD600值。每個處理設3次重復，以等量無菌水的LB液體培養基為對照[8-9]。

（3）NaCl濃度對菌株ck-05生長的影響

基礎培養基為LB液體培養基，其中NaCl濃度分別設置成0、5、10、15、20、25 g/L等6個梯度。將1 mL菌株ck-05種子培養液分別接種至不同NaCl濃度的液體培養基中，于30 ℃、200 r/min搖床中震蕩培養48 h后測OD600值。每個處理設3次重復，以等量無菌水的LB液體培養基為對照[9-10]。

（4）菌株ck-05最適生長溫度的測定

將1 mL菌株ck-05種子培養液接種于50 mL、pH為7.0的LB液體培養基中，分別于10、15、20、25、30、35、40、45、50 ℃，200 r/min搖床中震蕩培養，48 h后測OD600值。每個處理設3次重復，以等量無菌水的LB液體培養基為對照[10-11]。

1.5 數據處理

數據處理及繪圖采用WPS表格，數據統計分析采用SAS軟件。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

45 ℃培養48 h后，獲得1株具有抑菌作用的菌株ck-05，且抑菌譜廣，抑菌活性強。

2.2 菌株ck-05抑菌譜的測定

菌株ck-05對11種病原菌的抑制作用見表1。由表可以看出，菌株ck-05對11株植物病原菌均有抑制效果，對不同病原菌的抑制效果差異顯著，其中對香蕉枯萎病菌的抑制作用最強，抑菌帶直徑為22.0 mm，其次為花生果腐病菌和椰子莖腐病菌，抑菌帶直徑均為19.3 mm，對板栗疫病菌的抑制作用最差，抑菌帶直徑只有7.7 mm。由此可見，菌株ck-05抗菌范圍較廣。

表1 菌株ck-05對11種病原菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of strain ck-05 on 11 kinds of pathogenic bacteria

2.3 菌株ck-05的鑒定

2.3.1 菌株的形態學鑒定

圖1 菌株ck-05在LB平板上培養3 d的形態Fig.1 Morphology of strain ck-05 cultured on LB medium for 3 d

菌株ck-05在LB平板上30 ℃培養48 h后，菌落為圓形，小而突起，邊緣較整齊，稍透明，白色（見圖1）。在光學顯微鏡下觀察為短桿狀，革蘭氏染色為陽性，芽孢為橢圓形（見圖2）。

圖2 菌株ck-05的顯微形態Fig.2 Micromorphology of strain ck-05

2.3.2 菌株的生理生化鑒定

對菌株ck-05進行部分生理生化試驗，常規生理生化試驗結果（表2）表明，菌株ck-05的生理生化特征與《常見細菌系統鑒定手冊》中有關芽孢桿菌種屬鑒別特征基本一致，初步推測菌株ck-05為芽孢桿菌屬。

表2 菌株ck-05主要生理生化特征Table 2 The main physiological and biochemical characteristic of strain ck-05

2.3.3 菌株的分子學鑒定

菌株ck-05的16S rDNA經序列測定得到1 435 bp的基因片段。根據序列同源性從高到低的原則，挑取14株菌株的16S rDNA序列構建系統發育樹（圖3），結果顯示菌株ck-05與B.amyloliquefaciens（解淀粉芽孢桿菌）相似度達100%，結合形態特征和生理生化特征，鑒定菌株ck-05為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens，登錄號：MK592621）。

圖3 菌株ck-05系統發育樹Fig.3 The phylogenetic tree of strain ck-05

2.4 菌株ck-05的生長環境分析

2.4.1 pH值對菌株ck-05生長的影響

pH值對菌株ck-05生長的影響見圖4。由圖可知，pH對菌株ck-05生長的影響明顯。其中，pH在4.0～9.0范圍內菌株ck-05均能生長，在pH為10.0、11.0的條件下菌株ck-05幾乎不生長，其中pH7.0是菌株ck-05的最適宜pH，其OD600值為1.742。

圖4 pH對菌株ck-05生長的影響Fig.4 Effect of pH on the growth of strain ck-05

2.4.2 NaCl濃度對菌株ck-05生長的影響

由圖5可以看出，隨著NaCl濃度的增加，OD600值先增大后減少，當NaCl濃度為5 g/L時，菌株ck-05生長最好，OD600值最大，為1.233；在NaCl濃度為5～25 g/L時，隨著NaCl濃度的增加，菌株ck-05的生長逐漸被抑制。

圖5 NaCl對菌株ck-05生長的影響Fig.5 Effect of NaCl on the growth of strain ck-05

2.4.3 溫度對菌株ck-05的影響

溫度對菌株ck-05生長的影響見圖6。由圖可以看出，溫度對菌株ck-05生長的影響明顯，在30～45 ℃溫度范圍內，菌株均能生長很好；但在20 ℃以下、50 ℃以上時，菌株幾乎不生長。

圖6 溫度對菌株ck-05生長的影響Fig.6 Effect of temperature on the growth of strain ck-05

3 結論與討論

由于解淀粉芽孢桿菌能夠分泌多種抑菌物質，具有誘導作物產生抗性能力等優點，近年來其已成為研究生物防治的熱門菌種之一。如李楊等[12]研究發現解淀粉芽孢桿菌ZJ01對蘋果輪紋病菌有較強的抑制作用。權春善等[13]、王軍華等[14]研究發現解淀粉芽孢桿菌Q-12發酵液對病原菌菌絲細胞有強烈的破壞作用，能抑制病原菌菌絲的生長速度。王曉輝等[14]研究認為解淀粉芽孢桿菌K1發酵液可有效抑制灰霉病菌的生長。Arrebola等[15]的研究發現解淀粉芽孢桿菌PPCB004對青霉屬真菌的菌絲延伸有強烈的抑制作用，其中對殼青霉菌的抑制作用最強，抑菌率達73.3%。本研究篩選的菌株ck-05對供試的11種植物病原菌均具有較強的抑制作用，其中對香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌的抑制性最強，抑菌帶直徑為22.0mm，對檳榔炭疽病菌、檳榔心腐病菌的抑菌帶直徑分別為16.3 mm、14.7 mm，對板栗疫病菌的抑制效果最差，抑菌帶直徑只有7.7 mm。由此可知，菌株ck-05具有廣譜抑菌活性。結合形態學觀察、生理生化試驗及分子生物學技術等方法，菌株ck-05被鑒定為解淀粉芽孢桿菌。另外，生物學特性研究結果表明，菌株ck-05最適生長溫度30～45 ℃，20 ℃以下、50 ℃以上幾乎不生長；pH為7.0時，生長最佳；在NaCl濃度為5 g/L時，生長情況最好。

菌株ck-05具有廣譜抑菌活性，可將其開發為生防菌，研究成生物農藥，但將其開發成生防菌也有很多問題需要考慮：一是生產成本問題，生防菌與化學農藥相比分泌量較低，生產周期長，這些因素會相應增加生產成本；二是田間應用問題。一方面定殖能力有待深入研究，另一方面，田間復雜的微生物環境、溫度、pH等因素會影響生防菌的實際抑菌效果。然而，隨著科學技術的提高，這些問題會得到解決，將解淀粉芽孢桿菌開發成生物農藥會被廣泛地應用，本研究可為菌株ck-05的開發應用奠定理論基礎。