流動注射-光度法自動測定多種植物樣品中過氧化物酶活性

杜璞，李永生

(四川大學 化學工程學院，四川 成都 610065)

過氧化物酶(POD)是一種廣泛存在于真菌、細菌、陸生生物中以血紅素為輔基利用過氧化氫介導有機和無機底物氧化反應的氧化還原酶[1-2]。POD在多個領域應用廣泛[3-5]，商品POD多為辣根過氧化物酶(HRP)，但HRP產量低，價格昂貴，多種植物中POD的含量也較為可觀[6-9]，POD活性的準確測定可以篩選富含POD的植物樣品，對POD的提純及應用有重要意義。

POD活性測定方法多基于手工操作[10-12]，誤差大、效率低。流動注射分析(FIA)技術具有分析速度快、精密度高等特點[13-14]。本文基于GA/POD/H2O2反應體系建立一種可快速測定POD的流動注射光度分析系統(FIA-SP)，在反應非平衡態時準確、快速測定植物樣品中POD活性。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

愈創木酚(GA)、過氧化氫(30%)、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、濃鹽酸(質量分數36%～38%)均為分析純；辣根過氧化物酶(HRP，≥250 U/mg)，Sigma公司；實驗用水為脫氣超純水。

FIA-3110流動注射裝置；傲藝紫外-可見分光光度計；SHZ-D(Ⅲ)循環/水式多用真空泵；艾柯KL-UP-IV-20超純水儀；CP224S電子天平；800-1離心機；pXJ-1C+型離子活度計。

1.2 溶液配制

1.2.1 磷酸鹽緩沖液(PBS，0.05 mol/L，pH=6.0) 用電子天平分別稱取7.8 g的NaH2PO3·2H2O和17.8 g的Na2HPO3·12H2O，充分溶解后，分別移入1 L的容量瓶中，用超純水定容得到0.05 mol/L的磷酸二氫鈉溶液和磷酸氫二鈉溶液。取123 mL的磷酸二氫鈉溶液和877 mL的磷酸氫二鈉溶液混合，得到pH為6.0，濃度為0.05 mol/L 的PBS。

1.2.2 GA母液(45 mmol/L) 使用移液槍準確移取446 μL的GA于100 mL的容量瓶中，用PBS定容。

1.2.3 H2O2母液(15 mmol/L) 使用移液槍準確移取165 μL的H2O2溶液(30%)于100 mL的容量瓶中，用PBS定容。

1.2.4 HRP母液(10 000 U/L) 使用萬分之一的分析天平準確稱取0.001 g的HRP，溶解后移入 25 mL 的容量瓶中,用PBS定容。

1.2.5 植物粗酶液 將新鮮的植物樣品切成小塊，用榨汁機榨汁，于4 000 r/min 的離心機中離心 15 min。取出上清液，過濾，得到植物粗酶液。于冰箱中4 ℃下保存。

1.3 測定原理

本實驗基于H2O2/POD/GA的反應體系，在POD的催化下，H2O2和GA反應生成3，3′-二甲氧基-4，4′-聯苯二醌(2-GA)，該產物在470 nm處有最大吸收，反應方程式[15]見公式(1)：

(1)

根據酶活性定義：每分鐘消耗1 μmol底物需要的酶量為1個酶單位(U)，得到測定酶活性濃度(cE，U/L)的計算公式(2)：

(2)

式中 ΔA——在酶促反應一級階段產物2-GA吸光度的變化值，在FLA系統中為峰高；

Δt——一級反應階段所用時間，在FIA系統中，為從注樣時間到最高峰出現的留存時間，0.67 min；

n——底物GA與反應產物2-GA的物質的量之比，即n=2；

L——流通池光程，1 cm；

V/v——樣品的稀釋體積，即FIA系統中樣品分散度，5.921；

ε——反應產物2-GA的表觀摩爾吸光系數，

0.006 4 L/(μmol·cm)。

因此，在其他參數均確定的情況下，cE的值僅與ΔA/Δt有關，cE測定公式簡化為公式(3)：

(3)

1.4 實驗方法

FIA流路見圖1。FIA系統由蠕動泵(P)、多功能閥(V)、流通式光度檢測器和計算機組成。

當V處于“采樣”位時，P1、P2同時運行，酶樣和GA/H2O2混合試劑R在P2的抽吸作用下充滿樣品定量環(SL)和試劑定量環(RL)，多余液體從W1和W2排廢，PBS作為載流推動清洗劑定量環(CL)中的HCl清洗液塞，流經反應盤管(RC)和流通池清洗管路，得到一條基線，此時吸光度值為A0。

V轉到“注入”位，P2停止運行，P1繼續運行，PBS推動SL中的酶試樣塞追趕RL中的GA/H2O2混合試劑塞，并與之合并，進入RC中反應，GA和H2O2在POD的催化作用下反應生成2-GA，流經流通池時，得到產物吸光度值(A)，最后從W4流出，同時，清洗液HCl被注入CL中，多余液體從W3排廢。ΔA=A-A0，從注入到最高峰出現的時間即留存時間Δt，將ΔA/Δt代入公式(3)中可求出cE。

圖1 測定POD的FIA-光度法系統(RC反應盤管)Fig.1 FIA-spectrophotometry system for determination of POD

2 結果與討論

2.1 FIA系統參數的優選

基于前期手工法[9]將FIA系統初始參數設定如下：GA濃度為1.5 mmol/L，H2O2濃度為 0.5 mmol/L，兩者等體積混合為混合試劑R；SL體積為40 μL，RL體積為150 μL，CL體積為100 μL；PBS濃度為0.05 mol/L，pH為5.5；清洗液HCl濃度為0.4 mol/L；RC長度為100 cm；系統流速為 1.64 mL/min。采用單因素法優選FIA系統的各參數。

2.1.1 FIA系統流速優選 蠕動泵為FIA系統的流體驅動裝置，流速的大小影響反應進程和分析速度，用HRP標液作為樣品，考察系統流速對ΔA的影響，結果見圖2。

圖2 FIA系統流速對產物吸光度的影響Fig.2 Effect of flow velocity of FIA system onabsorbance of product

由圖2可知，ΔA隨著流速的提高先增大后減小，流速為1.91 mL/min時，ΔA最大。其原因是流速較低時，隨著流速的增加，樣品塞追上試劑塞后能更快地融合反應，ΔA也增大，當流速過大，樣品塞和試劑塞結合后的反應速度小于流動速度，未充分反應就從流通池流出。因此，優選系統流速為1.91 mL/min。

2.1.2 樣品進樣體積優選 FIA系統樣品定量環SL即加入POD體積，不同體積POD會使酶促反應速率不同，影響系統靈敏度。用HRP標準溶液作為樣品，考察不同體積SL對ΔA的影響，結果見圖3。

圖3 樣品進樣體積對產物吸光度的影響Fig.3 Effect of sample injection volume onabsorbance of product

由圖3可知，隨著SL體積的增大，ΔA逐漸升高至穩定，當SL的體積超過40 μL，其對ΔA不再造成影響。原因是當SL體積過小時，隨著酶液體積的增加，反應速率也增加，當SL體積超過40 μL后，酶液過量，GA和H2O2的反應已到達平衡。為節省試劑，優選SL體積為40 μL。

2.1.3 試劑進樣體積優選 試劑定量環RL即加入GA/H2O2混合試劑體積，加入不同體積的底物會影響酶催化反應，從而影響產物的吸光度值。HRP標液作為樣品，考察不同體積RL對ΔA的影響，結果見圖4。

由圖4可知，隨著RL體積逐漸增大，ΔA先升高后降低，RL體積為150 μL時，ΔA最大。因此，優選RL體積為150 μL。

圖4 試劑進樣體積對產物吸光度的影響Fig.4 Effect of reagent injection volume onabsorbance of product

2.1.4 反應盤管長度優選 RC的長度影響反應進程和分析速度。HRP標液作為樣品，考察RC對ΔA的影響。結果表明，ΔA隨著RC長度增加先升高后降低，RC在200 cm時ΔA最大。原因是隨著RC長度的增加，反應時間增加，ΔA也逐漸增加，當RC超過200 cm時，反應產物的稀釋速率大于生成速率，導致ΔA下降。由于RC長度為150 cm時與200 cm時的ΔA相差不大，但HRP標液線性更好(ΔA=0.003 8x-0.242 2，r=0.999)，為加快系統分析速度，優選RC長度為150 cm。

2.1.5 載流濃度及pH優選 PBS的pH值和濃度會影響酶促反應。因此在上述優選條件下，分別考察PBS的酸度和濃度對ΔA的影響，結果見圖5。

圖5 PBS的pH值(a)和濃度(b)對產物吸光度的影響Fig.5 Effect of pH (a) and concentration (b) of PBS onabsorbance of product

由圖5可知，ΔA隨著PBS的pH增大而先增大再減小，pH為6.0時，產物吸光度值最大，而PBS的濃度對ΔA沒有影響，這說明POD的最適pH值為6.0。因此，優選PBS的濃度為0.05 mol/L，pH為6.0。

2.1.6 清洗劑HCl濃度及進樣體積優選 HCl作為清洗劑起到清洗殘留在系統中的褐色產物2-GA，進而降低系統基線漂移率的作用，因此需要優選HCl的濃度和CL體積。在上述優選的條件下，分別考察HCl的濃度和CL體積對系統基線漂移率的影響。結果表明，隨著HCl濃度和CL體積的增加，系統基線漂移率逐漸降低。進樣體積一定時，HCl濃度超過 0.24 mol/L 后對基線漂移率的影響較小，而CL體積過大會影響溶液折射率進而影響產物吸光度值。因此，優選HCl濃度為0.24 mol/L，CL體積為150 μL。

2.1.7 底物濃度優選 在上述優選條件下考察H2O2濃度(0.1～2 mmol/L)和GA濃度(0.1～5.5 mmol/L)對酶催化反應的影響，結果見圖6。

圖6 H2O2濃度(a)和GA濃度(b)對產物吸光度的影響Fig.6 Effect of concentration of H2O2 (a) andGA (b) on absorbance of product

由圖6可知，H2O2和GA對ΔA的影響趨勢相同，隨著H2O2和GA濃度的增大，ΔA逐漸增大至穩定，當H2O2濃度達到1.5 mmol/L，GA達到 4.5 mmol/L 時，ΔA不再變化。因此，優選底物濃度為H2O2濃度1.5 mmol/L，GA濃度4.5 mmol/L。分別以H2O2和GA為底物做Lineweaver-Burk雙倒數圖，得到以H2O2為底物時，HRP的米氏常數(Km)值為2.73 mmol/L，最大反應速率(Vm)為 2.84 mmol/(L·min)。以GA為底物時，HRP的Km為7.32 mmol/L，Vm為3.54 mmol/(L·min)。

2.2 2-GA表觀摩爾吸光系數的測定

為計算POD的酶活性需要在給定條件下準確測定2-GA的表觀摩爾吸光度值(ε)。由朗伯-比爾定律(A=εbc)可知，ε=A/bc，其中ε為表觀摩爾吸光系數[L/(μmol·cm)]，b為吸收光程(cm)，c為物質濃度(mol/L)，對于特定的有色物質，通過繪制濃度/吸光度的曲線，得到曲線斜率，可求出ε。由于反應產物2-GA不穩定，無法測得其濃度，由(1)式可知，通過增大H2O2和HRP的量，使化學平衡向右移動，使GA完全轉化為2-GA，可以通過GA的濃度間接獲得2-GA的濃度，再繪制2-GA濃度/吸光度曲線求出斜率，即ε2-GA。通過優選得到CH2O2/CGA>1.5，HRP濃度>800 U/L 時，GA可以完全轉化為2-GA。配制出H2O2濃度恒為1.2 mmol/L、GA濃度在200～600 μmol/L范圍內的混合試劑(CH2O2/CGA恒大于1.5)，用800 U/L的HRP溶液作為樣品，用FIA系統在溫度分別為18，40，60 ℃的條件下測出2-GA的吸光度值，求出對應的ε2-GA分別為0.006 4，0.006，0.006 L/(μmol·cm)，結果表明溫度對ε2-GA的測定無影響。在優選條件下，在FIA系統中測得的ε2-GA為0.006 4 L/(μmol·cm)，因此取ε2-GA為0.006 4 L/(μmol·cm)。

2.3 分析系統穩定性及工作曲線

在上述優選條件下，對本系統的穩定性及線性響應進行評價。對兩種不同濃度的HRP溶液(555，1 770 U/L)連續測定11次，實測曲線見圖7a，得到RSD分別為3.38%和1.40%，均小于5%，這說明FIA系統穩定性好、精密度高。

配制一系列HRP標準溶液作為樣品，考察本系統的線性響應范圍，實測曲線見圖7b，通過數學回歸處理，得到HRP濃度在153～2 752 U/L的范圍內線性良好(ΔA=0.000 35CE(HRP)+0.007 16，R2=0.998 8)。另外計算得到系統分析速度為90樣/h，檢出限為25.7 U/L。

圖7 FIA光度法系統重現性/線性響應評價Fig.7 Evoluation of repeatability and linearity forFIA-spectrophotometry system

2.4 實樣測定

從商場購買長白蘿卜、紫茄子、西胡瓜、嫩南瓜和大白菜，制備樣品粗酶液，用本方法測定酶活性，結果見表1。為進一步評價系統的準確性，進行加標回收實驗，在植物樣品中按照1+1體積比例添加HRP標液，用本系統測出加標后酶活，每次實驗前對HRP標準溶液的活性進行校正，結果表明回收率在95%～105%之間。

表1 植物樣品POD測定及回收結果Table 1 Results for determination of the real plantsamples and the recovery test

3 結論

基于H2O2/POD/GA反應體系建立一種新的可快速測定多種植物所含POD的FIA分析流路，在優化條件下，該方法檢測范圍為153～2 752 U/L，RSD≤3.38%，檢出限為25.7 U/L，分析速度為90樣/h。本方法的優點是：操作簡單、無人為誤差、分析速度快、精密度高、對試劑和樣品的消耗量小，可以快速篩選POD含量較高的植物樣品，對過氧化物酶的提純及應用有重要意義。