KLF5 介導p27kip1表達對膠質瘤U87 細胞增殖和侵襲的影響

方松，唐國強，陳加貝，李斌

郴州市第一人民醫院，湖南郴州423000

膠質瘤是由腦神經膠質細胞引起的惡性腫瘤，是中樞神經系統最常見的惡性腫瘤。由于膠質瘤的多灶性發展和復發特點，患者預后較差，平均生存時間僅11～15 個月［1］。因此，闡明膠質瘤增殖和侵襲的內在機制對尋找新的治療靶標具有重要意義。Kruppel 樣因子5（KLF5）是KLF 家族的關鍵成員，在不同類型腫瘤中發揮的作用不同。研究顯示，KLF5在前列腺癌和宮頸癌組織中表達缺失或下調，發揮抑癌基因的作用［2-3］，在非小細胞肺癌、胃癌、胰腺癌等腫瘤中具有促進細胞增殖、侵襲和遷移的作用［4-6］。YANG 等［7］報 道，MCM3AP-AS1/miR-211/KLF5/AGGF1 軸對膠質瘤血管生成具有調控作用，可作為膠質瘤抗血管生成治療的新靶標，提示KLF5可能與膠質瘤的增殖和侵襲有關。研究顯示，p27kip1是腫瘤惡性進展的抑制因子［8-9］，在乳腺癌中KLF5可抑制p27kip1的表達而發揮促癌作用［10］。2019 年7 月—2020 年6 月，我們采用小干擾RNA（siRNA）抑制膠質瘤細胞U87中KLF5表達，觀察其對膠質瘤細胞增殖和侵襲能力的影響，并探討p27kip1在此過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 人膠質瘤細胞系U87 購于中國科學院上海細胞庫；DMEM 培養基和胎牛血清購于美國Hyclone 公司；KLF5 siRNA 和p27kip1siRNA 購于廣州銳博生物技術有限公司；Lipofectamine2000 轉染試劑、蛋白裂解液和Giemsa 染液購于北京索萊寶試劑公司；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒和細胞周期檢測試劑盒購于上海碧云天生物試劑有限公司；細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細胞周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6），上皮間質轉化蛋白Snail1，以及KLF5、GAPDH 抗體購自英國Abcam 試劑公司；ECL 化學發光試劑盒購于美國Thermo 公司；MTS 試劑購自中國北京百奧萊博科技有限公司；Transwell 小室購自美國Coring試劑公司。

1.2 細胞培養 取U87細胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度細胞培養箱中培養。觀察細胞生長狀態，及時更換細胞培養基。顯微鏡下觀察細胞長滿時，采用胰酶按照1∶3的比例進行細胞傳代。

1.3 KLF5對膠質瘤細胞增殖和侵襲能力的影響及機制觀察

1.3.1 細胞分組與轉染 收集細胞，加入胰酶消化，制備單細胞懸液。以1.0×105/孔鋪至6 孔板中，將細胞分為si-NC 組、si-KLF5 組，放置培養箱中培養。待細胞貼壁后，si-NC 組加入10 pmol NC siRNA和含5 μg Lipofectamine2000 的無血清培養基混合液，si-KLF5 組加入10 pmol KLF5 siRNA 和含5 μg Lipofectamine2000 轉染試劑的無血清培養基混合液，置于培養箱中繼續培養。6 h后更換新鮮完全培養基，轉染48 h用于后續實驗。

1.3.2 細胞增殖能力觀察 采用MTS 法。收集兩組細胞，加入胰酶消化，離心收集細胞，加入培養基制成單細胞懸液，調整細胞密度為2×106/L。以2×103/孔接種至96 孔板，每組設5 個復孔，置于培養箱中培養。以細胞貼壁時計為0 h，于0、24、48、72 h取細胞加入MTS試劑孵育2 h，按照說明書采用全波長掃描儀檢測490 nm處各孔光密度（OD）值。

1.3.3 細胞周期檢測 收集兩組細胞（每組設置3個復孔），加入胰酶消化。每管1.0×106個細胞，PBS洗3 次，加入1 mL 80%乙醇4 ℃固定細胞2 h。PBS洗1 次后，加入500 μL 的細胞周期染色緩沖液、25 μL碘化丙啶（PI）染液和10 μL RNA酶，混勻后37 ℃避光孵育30 min。采用流式細胞儀檢測細胞在不同細胞周期的比例。

1.3.4 細胞侵襲能力觀察 采用Boyden 實驗。將基質膠稀釋后加入Transwell 小室中，制備Boyden 小室。收集兩組細胞，加入胰酶消化，無血清培養基重懸細胞后計數，調整細胞密度為1×106/mL。每組設3 個復孔，采用無血清培養基洗3 次，取100 μL 細胞加至Boyden 小室的上室中，500 μL 完全培養基加至Boyden 小室的下室中，放置細胞培養箱中培養。顯微鏡下觀察，Boyden 小室下室中有穿膜掉落的細胞時終止培養，用PBS 將Boyden 小室上室面未穿過的細胞洗去，甲醇固定小室15 min，并采用Giemsa 染色，干燥后顯微鏡下計數穿膜細胞數目。

1.3.5 細胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1 蛋白檢測 采用Western blotting 法。收集兩組細胞，加入蛋白裂解液，4 ℃、14 000 r/min 離心30 min。取蛋白上清液，BCA法檢測蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，煮沸變性。取蛋白樣品，加入凝膠，100 V電泳2 h分離目的蛋白，350 mA轉膜2 h將蛋白轉移到PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶常溫孵育1 h 封閉非特異性蛋白。依次加入目的蛋白的一抗（稀釋濃度均為1∶500）4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h。TBST 沖洗3 次，采用ECL 化學發光試劑盒顯示蛋白條帶，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以目標蛋白與內參GAPDH 條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。

1.4 干擾p27kip1表達對KLF5 作用下膠質瘤細胞增殖和侵襲能力的影響觀察 采用Western blotting 法檢測si-NC 組和si-KLF5 組p27kip1蛋白表達，結果顯示兩組p27kip1蛋白相對表達量分別為0.21 ± 0.03、0.59 ± 0.08，si-KLF5 組p27kip1蛋白表達高于si-NC組（P＜0.01）。取培養后的U87 細胞，分為si-NC 組、si-KLF5 組 和si-KLF5+si-p27kip1組，si-NC 組 加 入10 pmol NC siRNA 和含5 μg Lipofectamine2000 的無血清培養基混合液，si-KLF5 組加入10 pmol KLF5 siRNA 和含5 μg Lipofectamine2000 的無血清培養基混合液，si-KLF5+si-p27kip1組加入10 pmol KLF5 siRNA+10 pmol p27kip1siRNA 和 含 5 μg Lipofectamine2000 的無血清培養基混合液，按照“1.3.2”和“1.3.4”的方法檢測細胞增殖能力和侵襲能力。

1.5 統計學方法 采用SPSS17.0 統計軟件。計量資料以±s 表示，兩組間比較采用t檢驗，三組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 KLF5對膠質瘤細胞增殖和侵襲能力的影響

2.1.1 兩組細胞增殖能力比較 細胞培養48、72 h時，si-KLF5 組OD 值較si-NC 組降低（P 均＜0.01）。見表1。

表1 兩組不同時間點OD值比較（±s）

表1 兩組不同時間點OD值比較（±s）

注：與si-NC組比較，*P＜0.01。

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2.1.2 兩組細胞周期比較 si-KLF5 組G1期細胞比例較si-NC組增加（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組細胞周期比較（%，±s）

表2 兩組細胞周期比較（%，±s）

注：與si-NC組比較，*P＜0.05。

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2.1.3 兩組細胞侵襲能力比較 si-KLF5 組和si-NC 組的穿膜細胞數分別為（39.67 ± 6.94）、（85.33± 10.54）個，si-KLF5 組穿膜細胞數較si-NC 組減少（P＜0.01）。

2.1.4 兩組細胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1 蛋白表達比較 與si-NC 組相比，Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1蛋白表達水平均降低（P 均＜0.01）。見表3。

表3 兩組細胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1蛋白表達比較（±s）

表3 兩組細胞Cyclin D1、CDK4、CDK6、Snail1蛋白表達比較（±s）

注：與si-NC組比較，*P＜0.01。

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2.2 干擾p27kip1表達對KLF5 作用下的膠質瘤細胞增殖和侵襲能力的影響

2.2.1 三組細胞增殖能力比較 si-KLF5+si-p27kip1組細胞增殖能力較si-NC 組降低，較si-KLF5 組增加（P均＜0.05）。見表4。

表4 三組不同時間點OD值比較（±s）

表4 三組不同時間點OD值比較（±s）

注：與si-NC組比較，*P＜0.05；與si-KLF5組比較，#P＜0.05。

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2.2.2 三組細胞侵襲能力比較 si-NC 組、si-KLF5組、si-KLF5+si-p27kip1組的穿膜細胞數分別為（91.67± 13.20）、（40.67 ± 8.11）、（69.33 ± 6.08）個。si-KLF5+si-p27kip1組穿膜細胞數較si-NC 組減少（P＜0.01），較si-KLF5組增加（P＜0.05）。

3 討論

膠質瘤也稱為神經外胚層或神經上皮腫瘤，發生在神經外胚層中，通常表現出包括廣泛、快速和侵略性進展等一系列惡性特征，導致患者對手術、放療和化療的抵抗，致使大多數患者預后不良，并影響患者的身心健康。因此，探索膠質瘤進展的分子機制，對開發可改善患者預后的新療法至關重要。

KLF5 基因位于13q21 號染色體上，其蛋白包含富含脯氨酸的反式激活結構域和3 個鋅指結構域。大量研究表明，KLF5與人類惡性腫瘤之間存在密切關聯，可調節細胞增殖、血管生成、多能性、炎癥和遷移等許多關鍵細胞過程［11-12］。KLF5 通過調節DNA損傷檢查點蛋白抑制DNA 損傷反應，促進非小細胞肺癌患者對順鉑的耐藥性，抑制KLF5 可能是治療腫瘤的潛在靶點［4］。在甲狀腺癌中，干擾KLF5 表達可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力［13］。在膠質瘤中，KLF5 通過參與MCM3AP-AS1/miR-211/KLF5/AGGF1 軸促進膠質瘤的血管生成，敲低MCM3AP-AS1 可通過上調miR-211 表達降低KLF5、AGGF1表達，從而抑制血管生成［7］。這表明KLF5能夠促進膠質瘤的發生發展。本研究結果顯示，干擾KLF5 表達后，U87 細胞的增殖和侵襲能力降低，與KLF5 在前列腺癌和肝細胞肝癌中的研究［14-15］結果一致。

細胞增殖與細胞周期密切相關。Li 等［6］報道，KLF5 能夠促進胰腺癌細胞中細胞周期的G1/S 期進程，從而抑制胰腺癌細胞的增殖。本研究結果顯示，干擾KLF5 表達后，U87 細胞周期阻滯在G1期，這表明KLF5 促進膠質瘤細胞增殖的作用機制與調控細胞周期相關。

KLF5 作為一種重要的轉錄因子發揮多種作用機制。KLF5可通過促進核因子κB 從細胞質至細胞核的易位過程，促進甲狀腺癌細胞的增殖和侵襲能力［13］。KLF5 可通過調控Snail1 基因的表達，抑制宮頸癌細胞的上皮間質轉化過程，降低宮頸癌細胞的遷移和侵襲能力［3］。在乳腺癌中KLF5 調控的長鏈非編碼RNA RP1 通過抑制p27kip1發揮致癌作用［10］。p27kip1屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，被視為腫瘤抑制因子。p27kip1通過穩定Cyclin D1-CDK4/6復合物中止細胞周期G1～S 期相變進程［10］。同時研究顯示，p27kip1與腫瘤細胞的侵襲和遷移相關，p27kip1陽性表達與食管癌患者的淋巴結轉移呈負相關［16］，RP1 通過抑制p27kip1蛋白表達調控Snail1 蛋白來維持乳腺癌細胞的上皮間質轉化［10］。本研究結果顯示，干擾KLF5 表達后，U87 細胞p27kip1蛋白表達增加，細胞周期相關蛋白Cyclin D1、CDK4、CDK6 表達降低，上皮間質轉化蛋白Snail1 表達降低，表明干擾KLF5 表達可能通過促進p27kip1表達抑制Cyclin D1、CDK4、CDK6 和Snail1 的表達，進而抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲能力。進一步在KLF5 siRNA 干擾組中抑制p27kip1表達后發現，減少p27kip1表達可以增加KLF5 siRNA 組細胞的增殖和侵襲能力，進一步表明KLF5介導p27kip1的表達促進膠質瘤細胞的進展。

綜上所述，干擾KLF5 的表達抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲能力，可能介導p27kip1的表達調控細胞周期蛋白的上皮間質轉化蛋白實現的，KLF5可能是抗膠質瘤治療的潛在分子靶點。但是本文未對KLF5 與p27kip1之間的具體作用機制進行研究，存在不足，有待后續繼續深入探討。