原因不明復發性自然流產患者血清IL-10 水平變化及其與miR-513c-5p的調控關系

尹紅，魏然，張振，朱肖肖，郭強，褚楚，付笑笑，趙霖，李霞

1 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）基礎醫學院，濟南250062；

2 山東第一醫科大學附屬省立醫院

復發性自然流產（RSA）是指與同一配偶發生兩次或兩次以上的自然流產，發病率為1%～5%，嚴重威脅女性生殖健康［1-2］。近50%的RSA 病因是未知的，被稱為原因不明復發性自然流產（URSA）。從免疫學角度認為，正常妊娠類似于成功的同種異體移植，如果免疫耐受狀態被破壞將導致流產發生［3-4］。隨著生殖免疫學的發展，細胞因子在維持正常妊娠過程中發揮的作用備受關注。白細胞介素10（IL-10）是體內重要的調節性細胞因子，在維持機體內環境穩定及誘導免疫耐受過程中具有重要作用。研究發現，URSA 患者血清IL-10 水平低于正常妊娠婦女，提示IL-10 可能參與了URSA 的發生，但導致該現象的原因尚不清楚。微小RNA（miRNA）是一種內源性非編碼RNA，可通過與mRNA 的3"非翻譯區（3"UTR）結合以調控靶基因表達與功能，從而參與增殖、凋亡等多個生理過程。越來越多的研究發現，miRNA 參與了URSA 發生與發展，但尚不清楚其是否可通過調控IL-10 參與URSA 的發生。本研究通過檢測URSA 患者外周血IL-10 及miR-513c-5p 水平變化，結合體外細胞實驗，探討miR-513c-5p對IL-10是否存在調控作用，從生殖免疫調控角度探究URSA 發病機制，為臨床治療提供新的靶點與依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 將2019 年1 月—2020 年1 月山東第一醫科大學附屬省立醫院婦產科病房及門診就診的URSA 患者和正常早孕婦女作為研究對象，URSA患者及正常妊娠婦女納入標準參照本課題組前期文獻報道［5-6］。本研究共納入URSA 患者（URSA 組）和正常早孕婦女（正常妊娠組）各30 例，URSA 組孕（7.5±1.2）周、年齡（27.2±4.1）歲，對照組孕（7.7± 1.1）周、年齡（26.9 ± 4.5）歲。兩組孕周、年齡具有可比性。本研究經山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）基礎醫學院（基礎醫學研究所）倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 標本采集與試劑準備 采集兩組清晨空腹靜脈血6 mL，離心分離血清用于ELISA 法檢測IL-10蛋白，經淋巴細胞分離液試劑盒分離外周血單個核細胞（PBMC）用于qPCR 法檢測miR-513c-5p 表達及IL-10 mRNA。實 驗 試 劑：TRIzol Reagent、UItra-SYBR Mixture 均購于北京康為世紀生物科技公司；miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 及HiScript ⅡQ RT Super Mix for qPCR Kit 均購于南京諾唯贊生物科技有限公司；293T 細胞購于南京科佰生物科技有限公司；Lipofectamine2000購于美國Invitrogen公司；IL-10 ELISA 試劑盒購于杭州聯科生物技術有限公司；人外周血淋巴細胞分離液試劑盒購于北京華越洋生物科技有限公司；miR-513c-5p 過表達（mimics）、抑表達（inhibitor）、陰性對照（NC）序列見表1；qPCR 引物及內參照U6逆轉錄引物由上海博尚生物技術有限公司設計合成，目的基因IL-10 qPCR 引物及內參照GAPDH 由上海吉瑪公司設計合成，引物序列見表2；野生型與突變型IL-10 3"UTR 載體均由美國Promega公司設計合成。

表1 miR-513c-5p過表達、抑表達及其陰性對照轉染物序列

1.3 外周血中IL-10蛋白及miR-513c-5p檢測

1.3.1 IL-10蛋白檢測 取離心所得血清，以ELISA法檢測IL-10蛋白，嚴格按照說明書操作。使用酶標儀測定雙波長（450 nm、630 nm）時的光密度（OD）值，依據標準品OD 值繪制標準曲線，按照OD450-OD630值計算IL-10蛋白濃度。

1.3.2 miR-513c-5p 檢測 各組細胞總RNA 以TRIzol 法進行提取，RNA 濃度與純度用紫外分光光度儀進行測定。按照諾維贊公司miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit 說明書進行miRNA 的cDNA 合成，選用UltraSYBR Mixture PCR 反應體系進行PCR擴增，選用U6作為內參，以2-ΔΔCt法計算miR-513c-5p相對表達量。

1.4 miR-513c-5p 與IL-10 關系的預測 選用Target Scan7.1 生物信息學軟件，分析miR-513c-5p與IL-10 mRNA 3"UTR之間是否存在直接的結合。

1.5 miR-513c-5p 與IL-10 mRNA 3"UTR 結 合 位 點驗證 以pmirGLO為載體構建包含結合位點的野生型及突變型IL-10 mRNA 3"UTR 質粒，然后轉染至293T 細 胞，同 時 分 別 轉 染miR-513c-5p mimics 及NC，檢測雙熒光素酶報告基因活性。

1.6 miR-513c-5p 調控IL-10 蛋白表達情況觀察 將293T細胞分為過表達組、抑表達組與空白對照組，以Lipofectamine2000 分別轉染miR-513c-5p mimics、inhibitor 及NC；24 h 后收集各組細胞，ELISA法檢測培養上清液中的IL-10 蛋白，qPCR 法檢測細胞中的IL-10 mRNA，檢測與計算方法同1.3.1。

1.7 統計學方法 采用GraphPad Prism Version 8統計軟件。計數資料均以±s 表示，兩組數據比較采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

表2 IL-10 mRNA、miR-513c-5p及其對照基因的引物序列和產物片段長度

2 結果

2.1 正常妊娠組及URSA 組血清IL-10 蛋白及PBMC 中miR-513c-5p 表達水平比較 由表3 可見，URSA 組較正常妊娠組外周血IL-10 蛋白水平降低而miR-513c-5p表達升高（P均＜0.05）。

表3 兩組血清IL-10蛋白及PBMC中miR-513c-5p表達比較（±s）

表3 兩組血清IL-10蛋白及PBMC中miR-513c-5p表達比較（±s）

注：與正常妊娠組比較，*P＜0.05。

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2.2 miR-513c-5p 與IL-10 關系的生物信息學預測結果 由表4 可見，miR-513c-5p 與IL-10 mRNA 3"UTR 之間具有潛在的互補結合位點，提示miR-513c-5p可能通過結合IL-10 mRNA的3"UTR進而抑制其轉錄水平及蛋白表達。見表4。

表4 miR-513c-5p與IL-10 3′UTR結合位點的預測結果

2.3 miR-513c-5p 對IL-10 mRNA 3"UTR 熒 光 素 酶報告基因活性的影響 由表5 可見，轉染miR-513c-5p mimics 可以降低野生型IL-10 mRNA 3"UTR 熒光素酶報告基因活性（P＜0.05），但對突變型IL-10 mRNA 3"UTR報告基因活性無顯著影響（P＞0.05）。

表5 miR-513c-5p對IL-10 mRNA 3"UTR熒光素酶報告基因活性調控（±s）

表5 miR-513c-5p對IL-10 mRNA 3"UTR熒光素酶報告基因活性調控（±s）

注：與NC比較，*P＜0.05。

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2.4 miR-513c-5p 對IL-10 mRNA 及蛋白表達的影響 由表6 可見，細胞中IL-10 mRNA 表達及細胞上清中IL-10 蛋白水平抑表達組＞對照組＞過表達組（P均＜0.05）。

表6 miR-513c-5p對IL-10 mRNA及蛋白表達的影響（±s）

表6 miR-513c-5p對IL-10 mRNA及蛋白表達的影響（±s）

注：與空白對照組比較，*P＜0.05。

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3 討論

自2015 年我國全面實施二胎生育政策以來，高齡孕產婦的數量逐漸增多，URSA 發病率呈現增長趨勢，URSA 不僅嚴重影響育齡婦女生殖健康，也給患者及其家庭乃至社會帶來巨大壓力。因此，闡釋URSA 的發病機制、探索其診治方法具有重要的臨床價值和研究意義。研究發現，約80%的URSA 發病機制與免疫功能異常有關。隨著生殖免疫研究的不斷深入，維持母胎免疫耐受形成和導致RSA 發生的免疫失衡機制研究已經從系統免疫逐漸深入到母胎界面的細胞和分子微觀水平［7］。

IL 是一組由多種細胞產生的可介導白細胞或免疫細胞間相互作用，發揮免疫調節功能的細胞因子。其中，IL-10 是一種重要的調節性細胞因子，主要由多種免疫細胞如T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等分泌［8］。IL-10 在炎癥抑制和免疫調控過程中發揮了關鍵作用，其表達與功能異常參與了炎癥、腫瘤等多種疾病的發生與發展［9-10］。母胎界面免疫研究發現，IL-10 在生殖免疫調控中發揮重要作用［11］。研究顯示，URSA 患者外周血及局部母胎界面IL-10 表達均低于正常妊娠婦女，提示IL-10 參與了URSA 的發生與發展，但致使URSA中IL-10 表達降低的上游調控靶點還不十分清楚。因此，探索URSA 中IL-10 表達異常的調控機制將進一步從生殖免疫調控角度闡釋URSA 的發病機制，為臨床治療提供新的依據。

隨著生命科學研究的不斷發展，人們發現曾因不能編碼蛋白質而被稱為基因組中不被關注的RNA 或“垃圾RNA”的非編碼RNA 在許多生命活動過程中發揮了很重要的作用，成為生物醫學研究的熱點。miRNA 是重要的非編碼RNA 之一，是一組長度為21～25 個核苷酸生物體基因組編碼的內源性非編碼小分子RNA。miRNA 具有高度保守性，是一類重要的基因表達調控因子，其作用于mRNA 主要的三個途徑是靶基因裂解、翻譯抑制或翻譯增強。研究發現，miRNA 在細胞的增殖、分化、凋亡等生理過程中發揮重要作用，其表達異常參與了多種疾病如腫瘤的發生發展及血管損傷等病理過程［12］。研究顯示，miRNA 調控其靶基因表達與功能異常參與了自然流產的發生。例如，研究發現RSA 患者miR-365 表達升高，升高的miR-365 通過誘導滋養細胞凋亡參與流產發生［13］。此外，研究報道RSA 患者miR-27a-3p 表達升高通過靶向泛素特異性蛋白酶25（USP25）抑制滋養細胞遷移和侵襲導致流產發生［14］。我們的前期研究發現，miR-6165 能夠靶向信號轉導和轉錄活化因子3（STAT3）抑制pDC亞群分化打破母胎免疫耐受導致流產［15］，并發現miR-103 能夠通過抑制信號轉導和轉錄活化因子1（STAT1）逆轉巨噬細胞極化異常減輕流產發生［16］。但是，miRNA 調控IL-10 表達在URSA 中作用與機制的研究尚未見報道［17］。

miR-513c-5p 是由位于人的X 染色體的編碼基因編碼的長度為22 個核苷酸的內源性非編碼單鏈小分子RNA，參與了多種癌癥的發生發展多有報道，但其在妊娠及妊娠相關疾病的中作用仍不清楚［18-19］。本研究發現，URSA 組患者外周血PBMC 中miR-513c-5p較正常妊娠組表達明顯升高，提示升高的miR-513c-5p 可能參與了URSA 發生。通過生物信息軟件Target Scan 預測，我們發現miR-513c-5p與IL-10 mRNA 的3"UTR 之間存在潛在堿基互補結合位點，進一步提示miR-513c-5p 可能通過結合IL-10 mRNA 3"UTR 從而抑制其轉錄和蛋白表達。為證實這一設想，我們進行了雙熒光素酶報告基因實驗，結果證實miR-513c-5p與IL-10 mRNA 3"UTR可以堿基互補而直接結合。在這一發現的基礎上，我們選用293T 細胞作為工具細胞，轉染miR-513c-5p mimics上調miR-513c-5p 表達后，發現IL-10 mRNA 及蛋白表達水平均顯著降低；而且，在轉染miR-513c-5p inhibitor 抑制miR-513c-5p 表達后，IL-10 mRNA 及蛋白表達均顯著升高。以上結果提示，miR-513c-5p能夠通過與IL-10 mRNA 3"UTR 直接結合進而抑制IL-10 mRNA轉錄及蛋白表達。

綜上所述，本研究結果證實miR-513c-5p 升高參與了URSA 的發生，闡釋了miR-513c-5p 異常升高通過抑制其靶基因IL-10 的轉錄與翻譯進而打破母胎免疫耐受狀態導致URSA。本研究從非編碼RNA表觀遺傳調控母胎免疫耐受角度進一步闡釋了URSA 的發病機制，提示miR-513c-5p 有望成為URSA 診斷與預后評估的新的生物學指標，靶向調控miR-513c-5p/ IL-10 信號通路可能為臨床治療URSA的有效方法。