金絲桃苷對心力衰竭大鼠肝纖維化的影響及其分子機制

郭曉，曲鳳霞，辛越，王鑑萌，李海英，馬愛青，趙偉

1 青島阜外心血管病醫院，山東青島266000；2 青島大學附屬醫院

心力衰竭（以下簡稱心衰）是以急性呼吸困難為癥狀的反復發作的心血管疾病，常并發肝功能紊亂，導致預后很差，病死率升高［1］。新近研究發現，心衰與肝纖維化的發生密切相關［2-3］。TGF-β1/Smad 通路可活化肝星形細胞并高表達促纖維化因子［如結締組織生長因子（CTGF）］，從而加重肝纖維化；而TIMP/MMP 軸則是調控細胞外基質（ECM）合成和降解的分子軸，二者活性失衡是導致肝纖維化進展的重要因素。金絲桃苷是黃酮醇苷類化合物，具有廣泛的藥理作用。其對不同因素導致的肝損傷或肝纖維化均有抑制作用［4-6］。然而，金絲桃苷對心衰引起肝纖維化的作用及其相關分子機制尚不明確。2018年6 月—2020 年4 月，我們通過建立大鼠心衰模型，觀察金絲桃苷對大鼠心衰引起肝纖維化的影響，并從TGF-β1/Smad 通路和TIMP/MMP 軸的角度探討其分子機制，旨在為臨床應用金絲桃苷治療心衰引起的肝纖維化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF 級雄性Wistar大鼠24只，體質量280～300 g，購自遼寧長生生物科技股份有限公司。飼養環境溫度（22 ± 1）℃、濕度45%～55%，循環照明12 h/12 h 模擬晝夜，自由進食飲水。適應性喂養1周后用于實驗。

1.1.2 藥物、試劑與儀器 金絲桃苷購自美侖生物公司，使用40%乙醇配置成相應濃度的溶液；磷鉬酸、酸性品紅、麗春紅購自國藥集團化學試劑有限公司；羊抗小鼠IgG-HRP、蘇木精、SYBR Green、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京Solarbio 公司；總RNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix 購自天根生化科技有限公司；丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、羥脯氨酸（Hyp）、丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）檢測試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司；CTGF、轉化生長因子β1（TGF-β1）、基質金屬蛋白酶1（MMP1）、基質金屬蛋白酶2（MMP2）、內參GAPDH抗體購自中國proteintech 公司；p-Smad2/3、Smad2/3抗體購自美國CST 公司；Ⅲ型膠原（collagenⅢ）、金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP1）抗體購自英國Abcam 公司。顯微鏡（OLUMPUS）；紫外可見分光光度計（上海佑科）；熒光定量PCR 儀（BIONEER）；多功能酶標儀（TECAN）；高分辨率小動物超聲系統（VisualSonics）。

1.2 動物分組與模型建立 參照Garcia 等［7］的腹主動脈—腔靜脈分流術誘導制作大鼠心衰模型。將大鼠隨機分為Sham 組、心衰組、100 mg/kg 金絲桃苷組、200 mg/kg 金絲桃苷組，每組各6 只。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定。在腹部正中線偏左行縱切口，分離皮膚、皮下組織、肌肉及腹膜，充分暴露腹主動脈段。心衰組和金絲桃苷組用動脈夾將左腎起始部腹主動脈夾閉，以腹主動脈的左腎動脈起始部至其末端段的下2/3 處之左側壁為穿刺點，用18 G 針頭以45°角水平穿刺腹主動脈壁，整個針尖部進入相鄰的下腔靜脈內。固定針頭，縫合腹主動脈左側壁破口，拔出針頭，打結，移走動脈夾，觀察到下腔靜脈顏色由暗紅變紅，分流明顯。將腹腔內器官復位，逐層縫合腹肌和皮膚。Sham 組充分暴露腹主動脈段后直接將腹腔內器官復位，逐層縫合。待大鼠完全蘇醒后放回籠中繼續飼養。

1.3 藥物干預 100 mg/kg金絲桃苷組和200 mg/kg金絲桃苷組分別給予金絲桃苷100、200 mg/kg灌胃，每天1 次，連續4 周。Sham 組和心衰組給予等體積乙醇溶液灌胃。

1.4 心功能檢查 最后1 次給藥后，通過面罩吸入異氟烷麻醉，仰臥位固定，使用小動物超聲系統測量心輸出量（CO）、左心室末期舒張壓（LVEDP）、左心室收縮末壓（LVESP）、左心室內壓最大上升速率（+dp/dtmax）和最大下降速率（-dp/dtmax）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV），計算左心室射血分數（LVEF）。

1.5 血清肝功能指標ALT、AST 檢測 收集大鼠腹主動脈血，離心分離血清，采用ELISA 法檢測ALT、AST活性。

1.6 肝臟系數測算 稱取大鼠體質量（BW）后，取出肝臟并稱取肝臟質量（LW），以LW/BW 計算肝臟系數。

1.7 肝臟組織病理檢查 取部分肝臟組織，加入4%甲醛溶液固定。常規脫水、石蠟包埋，連續切5 μm厚切片，二甲苯透明、梯度乙醇水化。肝臟組織行HE 光鏡下觀察組織病理變化。行Masson 染色，光鏡下觀察采集圖像，藍色為陽性染色。用Image pro-Plus6.0 軟件計算肝組織中的膠原形成面積，膠原形成面積=陽性染色面積/總面積×100%。

1.8 肝組織氧化應激指標Hyp、GSH-Px、MDA、T-SOD 檢測 取肝組織，采用堿水解法檢測Hyp，比色法檢測GSH-Px，硫代巴比妥酸法檢測MDA，羥胺法檢測T-SOD含量。

1.9 肝組織TGF-β1/Smad 通路和TIMP/MMP 軸相關基因表達檢測 采用Real-time PCR 法檢測TGFβ1/Smad 通路相關基因TGF-β1、CTGF 和TIMP/MMP軸相關基因TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢmRNA表達。取液氮凍存的肝臟組織樣本，提取組織總RNA，逆轉錄合成cDNA。取1 μL cDNA 為模板，向體系中加入上下游引物各0.5 μL，SYBR GREEN 0.3 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，最后用dd H2O 補足至20 μL。以GAPDH 為內參，置于ExicyclerTM96熒光定量PCR儀內進行實時熒光定量分析。引物序列：TGF-β1上游5"-AACAATTCCTGGCGTTACCT-3"，下游5"-GCCCTGTATTCCGTCTCCTT-3"；CTGF 上游5"-GTCTTCGGTGGGTCCGTGTA-3"，下游5"-GCGGTCCTTGGGCTCATCAC-3"； TIMP1 上 游 5"-CCTCTGGCATCCTCTTGTT-3"，下 游5"-CGAATCCTTTGAGCATCTTAG-3"；MMP1 上 游5"-GCCATTACTCACAACAATC-3"，下 游 5"-ATCACCTTCCTCCTCAAA-3"；MMP2上游5"-CCAAGAACTTCCGACTATCC-3"，下游：5"-GTCACTGTCCGCCAAATAAA-3"；collagenⅢ上游5"-GCCTTCTACACCTGCTCCTG-3"，下 游 5"-AGCCACCCATTCCTCCGACT-3"；GAPDH 上 游5"-GTGGAGTCTACTGGCGTCTT-3"， 下 游 5"-TTGCTGACAATCTTGAGGGA-3"。反應條件：94 ℃5 min，94 ℃10 s，60 ℃20 s，72 ℃30 s，40 個循環后，72 ℃2 min 30 s，40 ℃1 min 30 s。取PCR 擴增產物，常規行瓊脂糖凝膠電泳和成像系統掃描，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

1.10 肝組織TGF-β1/Smad 通路和TIMP/MMP 軸相關蛋白表達檢測 采用Western blotting 法。取肝臟組織標本，提取組織總蛋白，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度。行SDS-PAGE 電泳，電壓80 V。轉膜后用5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（稀釋比例：collagenⅢ一抗1∶5 000，p-Smad2/3、CTGF一抗1∶1 000，TGF-β1、Smad2/3、TIMP1、MMP1、MMP2 一抗1∶500），4 ℃孵育過夜。加入二抗（稀釋比例均為1∶3 000），37 ℃孵育45 min。ECL 底物發光后，掃描膠片，凝膠圖像處理系統分析目標條帶的灰度值。以目標蛋白與內參蛋白條帶灰度值的比值表示目標蛋白的相對表達量。

1.11 統計學方法 采用GraphPad Prism 7 統計軟件。計量資料以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組心功能指標比較 見表1。與Sham 組相比，心 衰 組CO、LVEF、+dp/dtmax及-dp/dtmax降 低，LVESP、LVEDP、LVESV 升高（P＜0.01）；與心衰組相比，金絲桃苷100 mg/kg組LVESP、LVEDP、LVESV降低（P 均＜0.01）；與心衰組相比，金絲桃苷200 mg/kg組LVESP、LVEDP、LVESV 降低（P 均＜0.01），CO、LVEF、+dp/dtmax及-dp/dtmax升高（P均＜0.05或＜0.01）。

表1 四組心功能指標比較（±s）

表1 四組心功能指標比較（±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.01；與心衰組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2 四組血清ALT、AST比較 見表2。與Sham組相比，心衰組ALT、AST水平升高（P均＜0.01）；與心衰組相比，100 mg/kg金絲桃苷組AST水平下降，200 mg/kg金 絲桃 苷 組ALT、AST 水平 均 下 降（P＜0.05 或＜0.01）。

表2 四組血清ALT、AST比較（IU/L，±s）

表2 四組血清ALT、AST比較（IU/L，±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與心衰組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.3 四組肝臟系數比較 心衰組、Sham 組及金絲桃苷100、200 mg/kg 組肝臟系數分別為（50.10 ±5.79）、（43.91 ± 0.40）、（47.49 ± 5.27）、（45.41 ±3.31）mg/g。心衰組肝臟系數較Sham 組有升高趨勢，金絲桃苷組肝臟系數較心衰組有降低趨勢，但各組間比較差異均無統計學意義（P均＞0.05）。

2.4 四組肝臟組織病理結果比較 Sham 組肝細胞排列整齊，肝小葉結構清晰，肝細胞索圍繞中央靜脈呈放射狀排列，未見明顯的炎性細胞浸潤及膠原纖維沉積；心衰組彌漫性的炎癥浸潤及脂肪變性，肝細胞變大，形狀不均，肝小葉結構消失，肝板破壞及中央靜脈坍塌，視野內廣泛藍染纖維間隔形成。與心衰組相比，金絲桃苷100 mg/kg 組及金絲桃苷200 mg/kg 組肝臟脂肪變性有不同程度的減輕，小葉結構清晰，肝細胞索排列規則，肝內炎細胞浸潤及肝細胞壞死程度減輕，纖維化程度減輕。與金絲桃苷100 mg/kg 組相比，金絲桃苷200 mg/kg 組上述病理變化均減輕。心衰組、Sham 組及金絲桃苷100、200 mg/kg 組肝臟組織膠原形成面積分別為26.17% ±2.90%、1.84%±0.25%、21.08%±2.69%、11.74%±1.83%，心衰組和金絲桃苷組膠原形成面積均高于Sham 組，金絲桃苷組低于心衰組，其中金絲桃苷200 mg/kg組低于100 mg/kg組（P均＜0.05）。

2.5 四組肝組織Hyp、GSH-Px、MDA、T-SOD 比較 見表3。

2.6 四組肝組織TGF-β1、CTGF 及TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢmRNA表達比較 見表4。

2.7 四 組 肝 組 織TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、CTGF 及TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢ蛋白表達比較 見表5。

表3 四組肝組織Hyp、GSH-Px、MDA、T-SOD比較（±s）

表3 四組肝組織Hyp、GSH-Px、MDA、T-SOD比較（±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與心衰組相比，#P＜0.05。

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表4 四組肝組織TGF-β1、CTGF及TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢmRNA相對表達量比較（±s）

表4 四組肝組織TGF-β1、CTGF及TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢmRNA相對表達量比較（±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與心衰組相比，#P＜0.05；與金絲桃苷100 mg/kg組相比，△P＜0.05。

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表5 四組肝組織TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、CTGF及TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢ蛋白相對表達量比較（±s）

表5 四組肝組織TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3、CTGF及TIMP1、MMP1、MMP2、collagenⅢ蛋白相對表達量比較（±s）

注：與Sham組相比，*P＜0.05；與心衰組相比，#P＜0.05；與金絲桃苷100 mg/kg組相比，△P＜0.05。

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3 討論

心臟泵血功能衰竭常導致其他器官的損害，尤其是肝臟。心功能障礙合并肝功能障礙增加了患者的病死率。這類疾病通常治療困難，且療效有限。因此，從中藥中尋找治療心臟合并肝臟功能障礙的新藥是十分必要的。既往研究表明，由于心臟衰竭，靜脈回流受阻，引起肝臟淤血，進而出現肝臟腫大，同時使肝細胞缺血得不到營養而壞死，導致肝臟受損及纖維化，在肝臟受損時，炎癥和一些細胞因子的分泌增加，這時處于靜息狀態的肝星形細胞被激活，進而分泌大量ECM，并表達一些促纖維化因子，從而進一步促進膠原纖維結締組織增生造成肝臟纖維化的加重［8］。本研究采用腹主動脈—腔靜脈分流術誘導制作大鼠心衰模型，觀察金絲桃苷對心衰導致的肝纖維化的影響及機制。結果顯示，與Sham組相比，心 衰 組CO、LVEF、+dp/dtmax及-dp/dtmax降 低，LVESP、LVEDP、LVESV 升高，提示大鼠出現心臟收縮和舒張功能障礙［9］。與心衰組相比，金絲桃苷100 mg/kg組LVESP、LVEDP、LVESV降低，金絲桃苷200 mg/kg 組LVESP、LVEDP、LVESV 降 低，CO、LVEF、+dp/dtmax及-dp/dtmax升高，表明金絲桃苷可改善心衰大鼠的血流動力學指標異常，進而改善心臟收縮和舒張功能。

肝臟系數即肝臟質量與體質量之比，當肝臟質量增加，肝臟系數就會隨之增大，提示肝臟可能發生水腫、增生、纖維化或肥大。本研究結果顯示，心衰組肝臟系數較Sham組有升高趨勢，金絲桃苷組肝臟系數較心衰組有降低趨勢，提示金絲桃苷可能改善肝纖維化；但各組間比較差異均無統計學意義，可能與檢測樣本量較少、病變時間較短有關。肝臟組織病理結果顯示，心衰組肝組織發生彌漫性的炎癥浸潤及脂肪變性，肝細胞變大，形狀不均，肝小葉結構消失，肝板破壞及中央靜脈坍塌，大量膠原纖維沉積，膠原形成面積顯著增加。在應用金絲桃苷治療后，大鼠肝臟脂肪變性、肝內炎細胞浸潤及肝細胞壞死程度、纖維化程度均減輕，膠原形成顯著被抑制，表明金絲桃苷可以改善心衰引起的肝臟病變及纖維化程度。

血清AST 和ALT 是反映肝損傷和肝纖維化程度的指標，在發生肝纖維化時顯著升高。膠原中Hyp 含量最高，檢測肝組織中Hyp 可反映肝臟纖維化程度。肝臟發生纖維化時常伴隨著脂質過氧化，MDA 是脂質代謝終產物，檢測其含量可反映組織損傷程度［10］。SOD 是機體的氧自由基清除劑，反映機體的抗氧化能力，GSH-Px可保護細胞膜結構和功能的完整性，清除體內的過多的脂質過氧化物［11］。本研究結果顯示，心衰組血清ALT、AST 及肝組織Hyp、MDA 較Sham 組升高，肝組織SOD、GSH-Px 較Sham 組下降，提示心衰引起肝臟發生纖維化損傷并伴隨著抗氧化能力下降，發生功能障礙。經金絲桃苷治療后，血清ALT、AST 及肝組織Hyp、MDA 顯著降低，肝組織SOD、GSH-Px 顯著升高，提示金絲桃苷能夠顯著改善心衰引起的肝纖維化，并恢復或緩解因肝纖維化引起的肝臟抗氧化能力的下降和肝臟功能障礙。

TGF-β1是一種強致纖維化細胞因子，其與下游的Smad 蛋白的磷酸化形式結合形成TGF-β1/Smad通路，激活該通路可將肝星形細胞活化為成纖維細胞，活化的肝星形細胞高表達CTGF，促進肝臟纖維化［12-13］。本研究結果顯示，心衰組肝組織中TGF-β1、p-Smad2/3 及CTGF 表達顯著升高，表明心衰可能通過激活TGF-β1/Smad 通路引起肝纖維化；金絲桃苷組肝組織中TGF-β1、p-Smad2/3 及CTGF 的表達較心衰組降低，提示金絲桃苷可能通過抑制TGF-β1/Smad通路的活化發揮對肝纖維化的抑制作用。

ECM 生成增加與降解減少與肝纖維化的發生密切相關。TIMP1 與MMP1、MMP2 能夠調節ECM的生成與降解，目前在不同因素誘導的大鼠纖維化模型中均證實TIMP1、MMP2 表達升高［13-14］，且研究表明TIMP1 主要抑制MMP1 對collagenⅠ、collagenⅢ的降解，促進纖維化過程［15］。本研究顯示，在心衰引起的肝纖維化模型中TIMP1、MMP2 及collagenⅢ表達顯著升高，而MMP1表達顯著下降，金絲桃苷能夠顯著抑制TIMP1、MMP2及collagenⅢ的表達，并顯著促進MMP1 的表達，進而改善了肝臟的纖維化程度。

綜上所述，金絲桃苷對心衰引起的肝纖維化具有保護作用，其可能的分子機制是調節TGF-β1/Smad 通路的活化及TIMP/MMP 軸的平衡，這一結果可為臨床上更合理的利用金絲桃苷治療心衰引起的肝纖維化提供一定的理論依據。