大蒜素對急性心肌梗死大鼠心功能和心肌纖維化的影響*

張麗娜，劉津軍，王紹偉

(邯鄲市中心醫院 心內三科，河北 邯鄲 056000)

隨著高血壓、高血脂、高血糖等基礎疾病患病人群的增加以及人口老齡化，急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的發病率呈逐年上升趨勢[1-2]。AMI發生后心肌血、氧供給不足導致心肌纖維化，是導致心功能損傷、心力衰竭和死亡的重要因素[3]。大蒜素是天然存在于大蒜鱗莖中的一種活性化合物，目前臨床上用于深部真菌和細菌感染的治療。近年來研究發現，大蒜素對肝纖維化、腎纖維化具有抑制作用[4-6]。本實驗探討大蒜素對AMI大鼠心功能和心肌纖維化的影響及其相關機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 健康、SPF級雄性SD大鼠100只，7周齡，體質量220 ～230 g，購自河北省實驗動物中心[SCXK(冀)2018-004]，實驗前適應性飼養7 d。

1.1.2藥物與試劑 大蒜素注射液(規格2 mL ∶30 mg)購自徐州萊恩藥業有限公司(批號20190714)，N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)ELISA試劑盒、Masson染色試劑盒購自北京博奧森生物科技有限公司，膠原蛋白Ⅰ(Collagen Ⅰ)、Collagen Ⅲ、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、轉化生長因子-β(TGF-β)以及磷酸化Smad2(p-Smad2)抗體購自北京索萊寶科技有限公司，二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒以及ECL化學發光試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.1.3主要儀器 ALC-V8型動物呼吸機和BL-A420型心電圖機(上海精密科學儀器有限公司)，Vevo-2100型動物超聲儀(加拿大Visual Sonics公司)、RM2235型石蠟切片機(德國Leica公司)、MTP-601F型熒光酶標儀(日本Corona公司)、IX81型倒置光學顯微鏡(日本Olympus公司)，VE-180型電泳槽、VE-186型轉膜儀(上海天能科技有限公司)，Flour Chem M型凝膠成像分析儀(美國Protein Simple公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1動物分組、給藥與模型制備 將100只實驗用大鼠按照隨機數字表法分為假手術組、模型組和大蒜素低、中、高劑量組(5、10和20 mg/kg)[7]，每組20只。取大蒜素注射液加入適量生理鹽水制備濃度為10 g/L的大蒜素溶液，并依次稀釋制備濃度5g/L和2.5 g/L的大蒜素溶液，造模手術前10 min，大蒜素低、中、高劑量分別腹腔注射給予濃度2.5、5、10 g/L的大蒜素溶液，注射劑量為2 mL/kg，假手術組和模型組同步腹腔注射同劑量生理鹽水(2 mL/kg)。參照吳慶景等[8]方法，在心電圖實時監控下，模型組和大蒜素各組結扎左冠狀動脈前降支復制AMI大鼠模型；結扎后左心室顏色蒼白、心電圖ST段弓背持續抬高或T波高聳，可判定造模成功[9]；假手術組除不結扎左冠狀動脈前降支外，其余同模型組。術后24 h后行各指標檢測。

1.2.2心功能指標檢測 各組按照隨機數字表法隨機取10只大鼠，通過動物超聲儀檢測心功能指標[左心室舒張末期內徑(LVIDd)、收縮末期內徑(LVIDs)、射血分數(EF)、每搏輸出量(SV)]，連續檢測3個心動周期，取平均值。

1.2.3血清NT-proBNP水平檢測和心臟指數計算 麻醉后開腹，由腹主動脈取血，1 500 r/min離心10 min取血清，按照ELISA試劑盒操作說明處理后，通過酶標儀檢測血清NT-proBNP水平。稱量大鼠體質量(W1)，開胸取心臟，用生理鹽水沖洗干凈并拭干后稱重(W2)，心臟指數=(W2/W1)。

1.2.4心肌組織病理學檢查和心肌纖維化程度觀察 切取左心室心肌組織置于10%中性福馬林溶液中固定24 h，石蠟包埋、5 μm厚度連續切片。(1)行常規HE染色后，通過光學顯微鏡觀察心肌組織病理學改變并照相保存。(2)遵照Masson染色試劑盒操作說明處理，封片后通過顯微鏡觀察心肌纖維化程度(肌纖維呈紅色，膠原呈藍色)并照相保存；通過圖像分析系統計算膠原容積分數(CVF)，CVF(%)=(膠原面積/視野總面積)×100%。

1.2.5心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白檢測 取各組剩余的10只大鼠，麻醉后開胸取左心室心肌組織，剪碎后加入9倍量4 ℃裂解液、研磨勻漿，12 000 r/min離心20 min后取上清液，參照BCA試劑盒方法檢測總蛋白含量、95 ℃水浴5 min使蛋白變性后，以30 μg蛋白量上樣、SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h、PBS溶液洗膜后，滴加Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白抗體、β-actin抗體4 ℃、避光孵育12 h，洗膜后滴加二抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加ELC顯影，以β-actin為內參半定量目標蛋白表達量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠心功能

與假手術組比較，模型組大鼠LVIDd和LVIDs明顯升高，EF和SV明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素中、高劑量組LVIDd和LVIDs降低、EF和SV升高，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠LVIDd、LVIDs、EF和SV

2.2 血清NT-proBNP水平和心臟指數

與假手術組比較，模型組大鼠血清NT-proBNP水平和心臟指數明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，大蒜素低、中、高劑量組NT-proBNP水平降低，中、高劑量組心臟指數降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表2。

2.3 心肌組織學觀察

假手術組大鼠心肌組織形態、結構均未見異常；模型組可見心肌纖維斷裂、排列紊亂，細胞數量減少、排列不整，心肌細胞膜破裂，可見核碎裂、消失，核偏移固縮深染，大量炎性細胞浸潤等病理性改變；較模型組，大蒜素各劑量組上述心肌組織缺血性病理改變明顯改善，高劑量組心肌纖維未見明顯斷裂，炎性細胞浸潤明顯減輕，優于其它組。見圖1。

注：A為假手術組，B為模型組，C為大蒜素低劑量組，D為大蒜素中劑量組，E為大蒜素高劑量組。

2.4 大蒜素對AMI大鼠心肌纖維化的影響

假手術組大鼠可見少量、均勻分布的膠原纖維；模型組膠原含量明顯增多、分布不均，以血管周圍和纖維斷裂處增多較為顯著；較模型組，大蒜素各劑量組膠原含量呈不同程度減少，其中高劑量組血管周圍和纖維斷裂處膠原接近假手術組。較假手術組，模型組CVF明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)；較模型組，大蒜素中、高劑量組CVF明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2、表2。

表2 各組大鼠血清NT-proBNP水平、心臟指數及CVF

注：A為假手術組，B為模型組，C為大蒜素低劑量組，D為大蒜素中劑量組，E為大蒜素高劑量組。

2.5 心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表達

較假手術組，模型組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ以及MMP-2表達明顯上調，差異有統計學意義(P<0.01)；較模型組，大蒜素中、高劑量組Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ以及MMP-2表達明顯下調，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖3、表3。

表3 各組大鼠心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ以及MMP-2蛋白的表達

注：A為假手術組，B為模型組，C為大蒜素低劑量組，D為大蒜素中劑量組，E為大蒜素高劑量組。

2.6 心肌組織TGF-β、p-Smad2蛋白表達

較假手術組，模型組大鼠心肌組織TGF-β、p-Smad2表達明顯上調，差異有統計學意義(P<0.01)；較模型組，大蒜素中、高劑量組TGF-β、p-Smad2表達明顯下調，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4、表4。

注：A為假手術組，B為模型組，C為大蒜素低劑量組，D為大蒜素中劑量組，E為大蒜素高劑量組。

表4 各組大鼠心肌組織TGF-β、p-Smad2蛋白的表達

3 討論

AMI發生后，隨著心肌細胞壞死與間質細胞的大量增生導致心室的形態、結構發生轉變，即心室重構，從而影響心臟功能[10]，而心肌纖維化是導致心室重構、進而誘發心力衰竭甚至致死的重要因素[11-12]。因此，抑制心肌纖維化對改善AMI預后至關重要。

近年來，隨著中醫藥現代化研究的深入，中醫藥治療心血管疾病逐漸得到醫生和患者的關注與認可。大蒜素是天然存在于大蒜鱗莖中的一種二烯丙基三硫化物，具有抗炎、抗氧化等多種生物學活性[13-15]。目前臨床上主要用于深部真菌和細菌感染的治療，近年來對于大蒜素潛在適應癥開展了大量研究，其中大蒜素抗肝、腎纖維化作用已得到證實。血清NT-proBNP水平能夠反映心功能狀況，是心肌纖維化和心力衰竭的常用早期診斷指標[16-17]。本實驗結果顯示，經大蒜素干預能夠明顯降低AMI大鼠LVIDd、LVIDs值并提高EF、SV值，降低血清NT-proBNP水平和心臟指數，改善心肌纖維斷裂、細胞膜破裂、核碎裂消失，核偏移固縮深染以及炎性細胞浸潤等心肌組織病變，降低心肌纖維化程度，提示大蒜素具有保護AMI大鼠心功能并抑制其心肌纖維化的作用。

AMI發生后，心肌成纖維細胞在缺氧缺血環境中異常增殖，由其合成與分泌的Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ大量積累，是導致心肌纖維化的重要物質基礎[18-19]。基質金屬蛋白酶(MMPs)，尤其是MMP-2，能夠通過影響心肌膠原蛋白含量，進而參與心肌纖維化、心肌肥厚等生物學過程[20]。Meng等[21]研究發現TGF-β能夠激活多條信號通路，能夠通過誘導Smads磷酸化(p-Smads)刺激成纖維細胞增殖與合成、釋放膠原蛋白，并且能夠抑制細胞外基質降解，因此TGF-β/Smads信號通路在心肌纖維化過程中發揮著關鍵調控作用。此外，Yuan等[22]研究發現，通過藥物阻斷TGF-β/Smads信號通路則能夠抑制成纖維細胞增殖并下調Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達，能夠起到緩解心肌纖維化的作用。本研究發現，經大蒜素干預能夠明顯下調AMI大鼠心肌Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2、TGF-β以及p-Smad2表達，提示大蒜素對AMI大鼠心肌纖維化的抑制作用可能與抑制TGF-β/Smad信號通路，進而下調Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表達有關。

綜上所述，大蒜素具有保護AMI大鼠心功能并抑制心肌纖維化的作用，其機制可能與抑制TGF-β/Smad信號通路、下調Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、MMP-2蛋白表達有關。