口腔鱗狀細胞癌中SALL4調控相關miRNAs的鑒定及其抑制腫瘤轉移的機制*

晏燕，陳先卓，秘雙燕，吳增波**

(1.川北醫學院附屬醫院，四川 南充 637000；2.珠海拜博口腔醫院，廣東 珠海 519000)

口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是全球最為常見的惡性腫瘤之一，而我國每年新發病例數占全球發病總數的50.0%，居國內惡性腫瘤死亡率第2位[1]。目前，臨床上對于OSCC以手術治療為主，通過手術能切除病灶組織，延緩病情發展，且隨著外科技術、圍術期處理水平的提高，OSCC手術成功率得到提高[2]。但是，OSCC患者預后較差，5年生存率僅為40%～50%，這可能與患者術后腫瘤的復發、轉移有關[3]。已有臨床研究表明，上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transformation，EMT)在啟動上皮來源腫瘤中發揮了重要的作用[4]。在EMT過程中，E鈣黏蛋白、角蛋白等呈低表達，N鈣黏蛋白、波形蛋白等呈高表達，且隨著病情的不斷發展，細胞會脫離細胞束縛而發生遠處轉移[5]。人婆羅雙樹樣基因4(human borne double tree-like gene 4，SALL4)是新發現的含鋅指結構的轉錄因子，在原始生殖細胞腫瘤中呈特異性表達，并在早期胚胎發育過程中發揮了重要的作用[6]。既往研究表明，SALL4啟動子為STAT3結合區，具有激活細胞自我更新、胚胎干細胞功能調節能力，其傳導通路與腫瘤細胞基因表達存在緊密聯系，但是其具體作用機制及在腫瘤轉移中的作用尚未闡明[7]。因此，本文采取細胞對照方法進行研究，探討OSCC中SALL4調控相關miRNAs的鑒定及其抑制腫瘤轉移機制，現將結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 OSCC Tca8113細胞系購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.1.2主要試劑與儀器 青-鏈霉素胎牛血清、改良Eagle培養基(dulbecco's modification of eagle's medium dulbecco，DMEM)及高糖培養基(美國hyclone)，β-actin抗體(美國Santa Cruz)，LipfectmineTM2000轉染試劑(美國Invitrogen)，SALL4 RNA逆轉錄試劑盒(美國Ambion)、噻唑藍(methylthiazolydiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)試劑盒(日本同仁)，7500聚合酶鏈式反應基因擴增儀(美國ABI)，凝膠成像分析系統(北京六一)，細胞培養板(美國Gibco)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 OSCC Tca8113細胞接種于10%胎牛血清RMPI-1640培養基中，置37 ℃的5%CO2細胞培養箱中培養，待細胞融合80%后對細胞進行傳代培養，取第2代對數生長的細胞，備用。

1.2.2半定量逆轉錄多聚酶鏈式反應(semi-quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)法測定SALL4調控相關miRNAs表達 構建負載miRNA前體序列的慢病毒重組體轉染Tca8113細胞，上、下調Tca8113細胞內miRNA表達豐度，分別設為上調組與下調組，以單純Tca8113細胞作為對照；取處理后的細胞，加 trizol 500 μL充分混合均勻，加氯仿0.2 mL，15 s劇烈震蕩，常溫靜置2～3 min，3 500 r/min離心15 min[8-9]；取RNA沉淀，轉移到新的EP管中，加異丙醇0.5 mL，混合均勻置于-20 ℃冰箱，1 194 g離心10 min；充分洗滌RNA沉淀，加入DEPC 250 μL與乙醇750 μL，4 500 r/min離心5 min，取沉淀置工作臺干燥20 min；利用紫外分光度儀檢測RNA濃度并完成RNA提純(以Rnase作為空白對照)，在A260下測定吸光度值；采用Dnase酶處理RNA，處理完畢后放入冰箱中；利用RT-PCR完成轉染前后SALL4mRNA表達水平(表2)，設定PCR反應條件為30 ℃、10 min，42 ℃、30 min，99 ℃、5 min，5 ℃、5 min，連續35個循環，72 ℃、10 min延長；選擇獲得的擴增產物，放入1.5%瓊脂凝膠進行電泳，完畢后采用UVP凝膠圖像完成灰度值的測定，β-actin為內對照[10]。實驗所用印務序列見表1。

表1 實驗中所用引物

1.2.3Western blot方法檢測SALL4蛋白表達 分別取OSCC Tca8113的細胞，PBS連續洗滌3次，加RIPA后置冰上裂解30 min，4 ℃下2 500 r/min離心30 min，收集上清液，采用免疫組織化學蛋白定量(bicinchoninic acid，BCA)法定量測定蛋白含量；10.0%SDS-PAGE電泳分離蛋白，對半干轉法，速度1 000 r/min離心20 min，電轉移到PVDF膜封閉2 h；加SALL4蛋白一抗，4 ℃孵育過夜，TBS-T洗膜5次，5 min/次；加SALL4蛋白二抗連續孵育2 h，過夜，TBS-T 5次洗膜，5 min/次，加少許ECL增強化學檢測試劑，分子成像儀上獲得結果；利用雙熒光素酶報告系統進一步驗證miRNA對SALL4的靶向調控，經過鑒定的miRNA記為miRNA-S[11]。

1.2.4Transwell小室測定細胞侵襲能力 miRNA(miRNA-S)的前體序列載體，轉染Tca8113細胞，檢測SALL4調控相關的miRNA對Tca8113細胞侵襲、遷移能力的影響。將細胞放置于無血清培養基，調整細胞濃度為2×108個/L，備用；常規消化、離心后調整細胞密度為2×108個/L，取細胞懸液200 μL輕輕加入Transwell小室，再加10.0%血清DMEM培養液600 μL，待細胞沉到小室底膜后，小室整體放入培養箱，連續培養12 h；取出Transwell小室，去除室內培養基，4%多聚甲醛固定10 min，采用PBS溶液沖洗，采用結晶紫色染色液染色3 min，醫用棉棒輕輕擦拭小室膜上表面未穿過的細胞，PBS沖洗小室；載玻片上加PBS，置于小室上方，倒置顯微鏡下拍照，隨機取5個高倍鏡視野下，計算細胞穿過底膜的細胞數量，并分析細胞的遷移和侵襲數目[12-13]。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 SALL4 mRNA表達

結果顯示，上調組Tca8113細胞中SALL4 mRNA表達水平均高于下調組和對照組，下調組則低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組Tca8113細胞中SALL4 mRNA的表達

2.2 SALL4蛋白表達

結果顯示，上調組、下調組Tca8113細胞中SALL4蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，但均高于對照組且差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

注：(1)與對照組比較，P<0.05。

2.3 SALL4調控相關miRNAs的鑒定

結果顯示，雙熒光素酶報告系統進一步驗證miRNA 對SALL4 的靶向調控，經過鑒定的miRNA 記為miRNA-S。見圖2。

注：1、2及3分別為對照、miRNA及miRNA-S泳道。

2.4 細胞侵襲能力

結果顯示，上調組、下調組Tca8113細胞干預后遷移及侵襲細胞數比較，差異均無統計學意義(P>0.05)；但均少于對照組，且差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組Tca8113細胞遷移和侵襲數目的比較

3 討論

OSCC是臨床上常見的惡性腫瘤，且隨著人們生活方式方式的改變，導致疾病發生率呈上升趨勢，影響患者健康和生活[14]。臨床研究表明，OSCC的發生、發展是一個多因素過程，普遍認為與個體遺傳基因、不良生活習慣、腫瘤的預防及篩查有關，亦與原癌和抑癌基因失衡有關，導致基因發生突變或失活，引起惡性腫瘤復發率較高[15-16]。目前，臨床上對于OSCC以手術切除為主，利用手術能切除病灶組織，延緩病情發展，但是患者遠期治療預后較差，術后復發率較高[17-18]。SALL4是人體中常見的基因，能伴隨著組織、器官的成熟而成熟，其表達數量將呈下降趨勢[19]。但是，惡性腫瘤患者SALL4基因數量較高，能直接參與腫瘤的發生、發展[20]。本研究中，上調組Tca8113細胞中SALL4 mRNA表達水平均高于下調組和對照組(P<0.05)，對照組SALL4 mRNA表達水平低于下調組(P<0.05)，說明SALL4在OSCC患者中呈高表達，能直接參與疾病的發生、發展。

在人體內，SALL4基因突變常涉及多個器官缺陷的常染色體顯性疾病[21]。國外學者研究表明，在白血病、胃癌、結直腸癌、子宮內膜癌、結直腸癌、肝癌或子宮內膜癌患者中SALL4基因多呈高表達[22-23]；同時在正常人體血液系統中，SALL4在CD34陽性造血干/祖細胞中均呈高表達，隨著造血細胞成熟后，SALL4基因表達水平結果處于異常狀態[24-25]。為了進一步確定SALL4調控相關miRNAs在OSCC中的作用，本研究中采用雙熒光素酶報告系統進一步驗證miRNA對SALL4的靶向調控，經過鑒定的miRNA記為miRNA-S；上調組或下調組細胞干預后期遷移及侵襲細胞數比較差異均無統計學意義(P>0.05)；上調組或下調組干預后細胞的遷移及侵襲細胞數均少于對照組(P<0.05)，由此看出SALL4調控相關miRNAs在OSCC中以miRNA-S表達為主，能抑制口腔鱗狀細胞的增殖、生長，從而能延緩病情發展。

綜上所述，SALL4調控相關miRNAs在OSCC細胞中呈低表達，能抑制腫瘤細胞的侵襲、轉移，有望成為OSCC治療新靶點。