實時熒光環介導等溫擴增快速檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌方法的建立與評價*

趙峻英，董劍，何建春，梅小億，歐國平

(大足區人民醫院 檢驗科，重慶 402360)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(multiple-resistant staphylococcus aureus，MRSA)是金黃色葡萄球菌(staphylococcus aureus，SA)的一個獨特菌株，對多種抗生素耐藥，可引起嚴重的社區獲得性感染和醫源性感染[1-2]，由于其癥狀與其他細菌感染無明顯差異，臨床難以早期針對該菌感染進行精準診斷和治療。常規的細菌培養方法通常需要2～3 d，甚至更久，難以滿足臨床的需求，因此，快速、靈敏、準確的MRSA檢測手段，是控制其感染和流行的關鍵[3-4]。本研究擬以環介導恒溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和實時熒光技術相結合，構建實時熒光 LAMP(Rea-LAMP)，同時檢測葡萄球菌的mecA耐藥標志性基因和SA特有的femA基因，并與VITEK2 Compact全自動微生物分析儀鑒定結果進行比較，初步探討實時熒光 LAMP(Rea-LAMP)方法快速鑒定MRSA在臨床應用中的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 隨機抽取2015年10月—2019年10月經VITEK2 Compact全自動微生物分析儀鑒定并保存于-80 ℃冰箱的68株SA，其中MRSA 37株、MSSA 31株。本研究選擇的標準菌株為MSSA(ATCC25923)、MRSA(ATCC43300)、表皮葡萄球菌(ATCC49134)、溶血葡萄球菌(CGMCC1.10528)、人葡萄球菌(ATCC27844)、沃氏葡萄球菌(ATCC17917)、頭狀葡萄球菌(ATCC 35661)、科氏葡萄球菌(ATCC29974)、路鄧葡萄球菌(ATCC700328)、腐生葡萄球菌(ATCC49907)、耳狀葡萄球菌(ATCC33753)、產色葡萄球菌(ATCC 43764)、佩氏葡萄球菌(DSM19554)、中間葡萄球菌(ATCC51874)、大腸埃希菌(ATCC25922)、肺炎克雷伯桿菌(ATCC700603)、銅綠假單胞菌(ATCC27853)、鮑曼不動桿菌(ATCC19606)和糞腸球菌(ATCC29212)標準菌株，由國家衛生和計劃生育委員會臨床檢驗中心提供。

1.1.2儀器與試劑 DEAOU-308C迪澳恒溫熒光檢測儀、VITEK2 Compact全自動微生物分析儀、細菌核酸提取試劑盒購自重慶中元匯吉生物技術有限公司,Loopamp DNA擴增試劑盒、梅里埃DENSIMAT比濁儀99234。

1.2 方法

1.2.1細菌基因組DNA提取 將-80 ℃保存的19種標準菌株和68株臨床SA菌株接種于血平板上，于37 ℃溫箱培養18～24 h,取平板上的菌落于無菌生理鹽水中制成麥氏濁度為3.0～4.0的菌懸液1.5 mL，按細菌核酸提取試劑盒說明書操作步驟提取細菌DNA。

1.2.2引物設計與合成 從美國國立生物技術信息中心(national center for biotechnology information,NCBI)網站查找mecA和femA基因序列，并對查找到的基因序列使用Bioedit軟件進行比對，根據比對結果選擇保守區域利用LAMP引物設計軟件PrimerExplorer V5設計引物，引物序列由英濰捷基上海貿易有限公司合成。見表1。

表1 SA的Rea-LAMP檢測體系引物

1.2.3Rea-LAMP反應體系 將合成的引物序列F3、B3、FIP、BIP、LF、LB按1 ∶1 ∶8 ∶8 ∶4 ∶4混合配制引物混合液，然后取引物混合液1 μL進行Rea-LAMP反應，總反應體系25 μL：引物1 μL，2X反應液12.5 μL，鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)8U，待檢菌株DNA 2 μL，SYBR 0.5 μL，超純水補足至25 μL，在恒溫熒光檢測儀中進行反應(63 ℃，1 h)。

1.2.4特異性試驗 按1.2.1方法將提取的MRSA和MSSA及其他17種革蘭陽性和陰性標準菌株的全基因組DNA，按照Rea-LAMP的反應條件進行擴增，分析檢測信號并觀察熔解曲線，評價該體系引物的特異性。

1.2.5靈敏度試驗 測量提取的MRSA標準菌株全基因組DNA模板濃度，將濃度為1 mg/L的MRSA基因組DNA用超純水進行10倍梯度稀釋4次，得到5個不同濃度的DNA模板(1 000、100、10、1和0.1 μg/L),加入Rea-LAMP反應體系中進行反應，觀察擴增曲線，確定引物最低檢出限。

1.2.6重復性試驗 將MRSA和MSSA標準菌株作為陽性菌株，其余17種標準菌株作為陰性菌株，分別進行3次Rea-LAMP重復性試驗，所有標準菌株重復性試驗所用模板為同一模板。

1.2.7臨床菌株的檢測 用Rea-LAMP試驗體系對68株SA進行檢測，并與VITEK2 Compact全自動微生物分析儀鑒定結果進行比較。

2 結果

2.1 特異性檢測結果

MRSA標準菌株出現femA和mecA基因擴增曲線，MSSA標準菌株出現femA基因擴增曲線，其余17種病原菌的標準菌株未出現femA或mecA基因擴增曲線。擴增過程未出現引物二聚體的干擾，熔解曲線無雜峰。見圖1。

注：A為femA基因熔解曲線，B為mecA基因熔解曲線。

2.2 MRSA靈敏度試驗結果

本研究體系顯示1 μg/L MRSA基因組DNA約23 min出峰，出現擴增曲線，此濃度為本研究體系的最低檢測限,見圖2。

圖2 MRSA靈敏度檢測

2.3 各菌株重復性試驗結果

MRSA和MSSA各自的3個重復管幾乎同時出峰且擴增曲線幾乎重疊，其余菌株各自的3個重復管均無擴增曲線。

2.4 臨床菌株檢測結果

結果顯示，對68株臨床菌株檢測結果與VITEK2 Compact全自動微生物分析儀鑒定結果一致,見表2。

表2 本研究測試結果與VITEK2 Compact全自動微生物分析儀鑒定結果比較

3 討論

MRSA一直以來是全球引起感染性疾病的重要病原菌之一，其耐藥性嚴重、耐藥機制復雜，使得臨床感染死亡率增高，成為當今感染醫學的一個難題[5-7]。

相關研究證明，MRSA菌株的耐藥性主要由mecA基因介導[8-9],其編碼產生的青霉素結合蛋白2a(PBP2a)使菌株對β-內酰胺類抗生素的親和力明顯降低，從而使細菌產生耐藥性[10-12]。故SA一旦獲得mecA基因，便可表現為高度和多重耐藥。

femA基因為SA所特有的基因，也是MRSA耐藥性的輔助基因[13-14]，在MRSA中，femA基因啟動子或調控區域的插入，可使細菌細胞壁成分或結構發生改變，協助mecA基因降低對β-內酰胺類抗生素的敏感性，從而導致對甲氧西林耐藥[15-16]。

對于臨床實驗室而言，選擇合適的檢測方法，準確及時地發出檢驗報告尤為重要。LAMP是2000 年，由日本學者Notomi等[17]提出的一種恒溫核酸擴增技術，其特點是反應快、特異性強、靈敏度高、檢測成本低以及操作簡單等，被廣泛應用于分子診斷技術中[18-22]。本研究基于LAMP的基本原理，在mecA和femA基因序列上設計6條引物：2條外引物(F3、B3)、2條內引物(FIP、BIP)和2條環引物(LF、LB)，特異性識別mecA和femA基因序列上的6個獨立區域，啟動循環鏈置換反應。內引物雜交在目標DNA區域，啟動互補鏈的合成，再通過外引物在同一鏈上互補序列，這樣周而復始形成有很多莖-環DNA混合物。環引物提高了反應靈敏度，縮短了反應時間，從而實現對目的DNA序列的快速擴增。同時，在反應體系中加入了SYBR熒光染料，反應過程在DEAOU-308C迪澳恒溫熒光檢測儀中進行，可對整個反應過程進行實時動態檢測。

本研究將LAMP的快速性和實時熒光的敏感性有機結合起來建立了Rea-LAMP檢測MRSA的新方法，主要特點包括以下5個方面。(1)特異性強，在靶基因mecA和femA的6個不同的區域設計了6條不同引物，要使目標序列快速擴增，引物必須與靶序列的6個區域嚴格識別配對，不受非目標DNA的干擾。本實驗選取了MRSA、MSSA和17種其他常見病原菌的全基因組DNA同時作為模板在Rea-LAMP檢測體系中擴增，僅MRSA和MSSA出現相應的擴增曲線。(2)檢測靈敏度高，本Rea-LAMP檢測體系的靈敏度達1 μg/L。(3)速度快，1 h以內即可完成檢測，大大縮短了檢測周期。常規的細菌培養的檢測方法通常需要2～3 d，甚至更久，本研究與常規的細菌培養和鑒定方法相比時間大大縮短，與普通的PCR方法相比省去了PCR模板的高溫變性和低溫退火步驟，節約了溫度變化導致的時間耗損。(4)穩定性好，MRSA和MSSA作為陽性樣品，各自的3個重復管幾乎同時出峰且擴增曲線幾乎重疊，說明該反應體系具有良好的穩定性。(5)實時動態檢測，本研究體系通過收集熒光信號，可對擴增體系進行實時動態檢測，及時跟蹤檢驗結果。同時，由于本研究的熒光染料SYBR在反應前加入，避免了實驗反應結束后開蓋導致氣溶膠污染。

在臨床菌株檢測中，同時出現mecA和femA擴增曲線的為MRSA，只出現femA擴增曲線的為MSSA。所檢測的臨床68株SA中，檢測出MRSA37株，MSSA31株，與VITEK2 Compact全自動微生物分析儀鑒定結果一致。由于本研究體系所檢測的臨床菌株數量有限，需增加菌株的數量做進一步的驗證。本研究只是定性檢測，下一步需要將嘗試設計標準曲線用于定量檢測。本研究只能檢測mecA和femA基因，對與MRSA耐藥機制有關的其他基因如mecC基因等[23-25]無法檢出。也無法區分MRSA和MSSA感染或定植。

綜上所述，雖然本研究的Rea-LAMP檢測MRSA的體系具有一定的局限性，但具有特異性強、穩定性好、靈敏度高、操作簡單快捷的特點，并且能夠實時動態觀察檢測結果，可為MRSA提供一種新的的快速檢測方法。