重慶萬州疑似柑桔輪斑病的病原鑒定及防治藥劑篩選

占 爽，吳 望，胡軍華,2，吳玉珠，喬興華，陳 力，程 蘭，周 彥,2

(1 西南大學柑桔研究所，重慶，400712；2 農業部西南地區果樹科學觀測實驗站，重慶，400712；3 重慶市萬州區植物保護與果樹技術推廣站，重慶，404020)

2018年秋季至2019年春季，重慶市萬州區的尤力克檸檬種植區域，突發大面積柑桔植株枝梢枯死、大量葉片枯萎伴隨大量落果的現象，并且在鄰近的臍橙和雜柑上也有類似現象發生。按照柑桔炭疽病采取相應的防控措施未能有效控制病害。從發病季節及主要癥狀來看，高度疑似由Pseudofabraeacitricarpa引起的柑桔真菌病害——柑桔輪斑病(the citrus target spot)[1-5]。在防治上，有研究者根據室內毒力測定，提出苯醚甲環唑、咪鮮胺對柑桔輪斑病病原菌有抑制作用[2]，但生產中可用于防控此病害的藥劑有限[3]。目前，關于柑桔輪斑病病原菌的侵染機制、致病機理及系統防控方案等尚無報道。為了明確重慶市萬州區疑似柑桔輪斑病的病原和初步篩選防控藥劑，以重慶萬州地區患病柑桔為材料，進行病原菌分離鑒定和致病性測定，同時進行常用殺菌劑室內毒力測試。

1 材料與方法

1.1 材料病害樣品：采自重慶市萬州區患病尤力克檸檬、北京檸檬和紐荷爾臍橙植株。

供試菌株：WZ1、WZ2和WZ3菌株分離自尤力克檸檬病害樣品，NHRQC1菌株分離自紐荷爾臍橙病害樣品，BJNM1菌株分離自北京檸檬病害樣品。在PDA培養基上，20 ℃恒溫培養10 d，4 ℃保存、備用。

供試組織材料：尤力克檸檬、紅桔、北京檸檬、塔羅科血橙、W·默科特桔橙、大雅柑、紐荷爾臍橙、北碚447錦橙均采摘自國家果樹種質重慶柑桔圃(重慶市北碚區歇馬街道中國農業科學院柑桔研究所內)。昭通蘋果(紅富士品種)和碭山酥梨果實均購買于重慶市北碚區歇馬街道超市。

1.2 致病菌鑒定觀察患病柑桔樣品，記錄其特征。采用組織塊分離法對樣品進行病菌分離。菌株純化后，挑取少量菌絲，加入30 μL 2× T5 Direct PCR Kit(Plant)(北京擎科新業生物技術有限公司)裂解液 Lysis Buffer A，95 ℃加熱20 min。常規引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)/ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)擴增ITS片段。25 μL PCR 反應體系：T5 Plant 12 μL，模板1 μL，ITS1/ITS4各1 μL，ddH2O 10 μL。ITS擴增反應程序為：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，35個循環；72 ℃補充延伸3 min。PCR擴增產物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送擎科公司測序。將測序結果序列提交至NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)數據庫中進行比對分析，用MEGA-X鄰接法(Neighbor-Joining)進行聚類分析，構建系統進化樹(1 000次重復)。

1.3 致病性測定取尤力克檸檬秋季展開而未轉綠葉片、未轉褐枝條和膨大期果實，用75%酒精消毒20 s，無菌水沖洗3次，備用。葉片設置正面及反面的無傷接種、針刺2針接種和針刺10針接種，共6種處理方式；枝條設置無傷接種、刻傷接種和去皮接種3種處理方式；果實設置無傷接種、針刺10針接種和去皮接種3種處理方式。各處理接種WZ1菌株，對照組接種無菌PDA培養基。接種后，20 ℃保濕培養，每日觀察發病情況，十字交叉法測量病斑直徑并記錄。

取其他柑桔品種的材料清洗完后，秋季展開未轉綠葉片采用正面針刺10針接種，未轉褐枝條采用去皮接種，膨大期果實采用針刺10針接種；昭通蘋果和碭山酥梨果實采用針刺10針接種處理。20個樣品一組，設置3次重復。各處理接種WZ1菌株，對照組接種PDA培養基。20 ℃保濕培養。十字交叉法測量病斑直徑并記錄。采用SPSS Statistics 25 軟件分析數據。

1.4 常用殺菌劑室內藥劑篩選供試殺菌劑包括：37%苯醚甲環唑WP(山東省綠士農藥有限公司)、450 g/L咪鮮胺EC(安道麥馬克西姆有限公司)、50%甲基硫菌靈SC(陜西湯普森生物科技有限公司)、3%噻霉酮ME(江蘇輝豐農化股份有限公司)、50%醚菌酯WP(利爾化學股份有限公司)、40%腈菌唑WP(美國陶氏益農有限公司)、60%唑醚·代森聯WP(巴斯夫歐洲公司)、30%堿式硫酸銅SC(保定農藥廠)、25%嘧菌酯SC(英國先正達有限公司)、11.5%吡唑嘧菌脂EC(石家莊市深泰化工有限公司)、50%啶酰菌胺WG(巴斯夫歐洲公司)、86.2%氧化亞銅WP(挪威勞頓克斯公司)、12.5%烯唑醇WP(江蘇托球農化股份有限公司)、99%噁霉靈DP(煙臺鑫潤精細化工有限公司)、250 g/L戊唑醇EW[安道麥(北京)農業技術有限公司]、75%肟菌·戊唑醇WG(德國拜耳作物科學公司)、46%氫氧化銅WP(上海生農生化制品股份有限公司)、60%霜脲·醚菌酯WP(美國世科姆公司)、70%丙森鋅WP(德國拜耳作物科學公司)、80%克菌丹WP[安道麥(北京)農業技術有限公司]、80%代森錳鋅WP(利民化工股份有限公司)、65%代森鋅WP(深圳諾普信農化股份有限公司)、99%礦物油EC(天津綠穎農藥銷售有限公司)。

采用菌絲生長速率法進行殺菌劑毒力測定[6]。將各殺菌劑配置成1 mg/mL的母液，再將母液稀釋成各濃度梯度，單獨或復配[7]與PDA培養基混合制成含有不同濃度藥劑的培養基，以加入等量無菌水的PDA培養基為空白對照。每處理3次重復。各含藥培養基接種WZ1菌株菌餅，20 ℃恒溫培養7 d后，采用十字交叉法測量菌落直徑。采用農藥室內生物測定數據處理系統(PBT)對各藥劑試驗結果進行統計分析，獲得各藥劑對菌株的毒力回歸方程、抑制中濃度(EC50)、抑制90%濃度(EC90)、相關系數(r)等。

2 結果與分析

2.1 癥狀及發病規律自2018年12月中旬開始，在萬州地區尤力克檸檬的葉片上發現了零星點狀病斑；2019年1—2月，田間開始出現大面積葉片枯萎、大量落葉，隨后枝條上的病斑逐漸擴展，導致整枝干枯，因而造成大量落果。病情發生非常迅速。2019年3月下旬左右，萬州區白羊、黃柏和太龍3個鎮(鄉)共10個村的尤力克檸檬種植區，葉片基本全部落光，枝條大部分枯死，發病區域面積約達100 hm2。在患病柑桔葉片上，可見明顯的圓形或橢圓形病斑，病斑中部為淺褐色凹陷，外圈深褐色并伴有黃色暈圈；在枝條上，呈現為眼狀輪紋枯萎病斑，病斑擴展后導致整個枝條枯死，隨后落葉、落果(見圖1)。

注：A—C 尤力克檸檬，D—F 紐荷爾臍橙，拍照時間2019年3月。圖1 重慶萬州疑似柑桔輪斑病的田間癥狀

2.2 病原菌鑒定在PDA培養基上，分離菌株(WZ1)的菌落邊緣光滑，氣生菌絲生長較旺盛。菌絲最初為白灰色或灰色，外圈為淺白色或淺黃色，后逐漸整體變成灰褐色、靠近中心少量白灰色，菌絲成棉絮狀且貼壁伸展。培養基背面最初為淺奶黃色，后逐漸產生深黑褐色圓圈，并不斷擴展至全黑。長時間培養菌株的培養基正面或背面會出現深黑褐色菌核。氣生菌絲隔膜明顯，產孢菌絲同氣生菌絲相同。在PDA培養基上，產生少量小型分生孢子，孢子呈橢圓形或長橢圓形，頂端鈍圓，向一側稍有彎曲；不產生厚垣孢子和剛毛(見圖2)。

注：A—B 菌落正、反面， C—D菌絲及其隔膜， E小型分生孢子。圖2 分離菌株(WZ1)的形態特征

將分離菌株(WZ1)接種在離體尤力克檸檬上，葉片出現中部凹陷深色、外圈伴有黃色暈圈的病斑，與田間癥狀一致；枝干上出現棕色病斑并逐漸擴大；果實出現水浸狀凹陷(見圖3)。從病斑上重新分離的菌株與接種菌株，在形態和ITS序列信息上一致。

圖3 分離菌株(WZ1)對尤力克檸檬離體組織的致病性

從重慶萬州尤力克檸檬患病樣品中分離得到3株菌株(WZ1、WZ2、WZ3)，在北京檸檬患病樣品中分離得到1株菌株(BJNM1)，在紐荷爾臍橙患病樣品中分離得到1株菌株(NHRQC1)。將測得的各菌株ITS序列放于NCBI進行BLAST分析，5株菌株與Pseudofabraeacitricarpa(KR859281.1)的相似度為100.00%。基于ITS1/ITS4序列構建系統進化樹，發現WZ1和WZ2聚在一起，并且與陜西城固柑桔輪斑病的病原菌SXL1(JN601676.1)處于不同分支；WZ3和BJNM1、NHRQC1聚在一起，且與SXL1(JN601676.1)處于同一分支(見圖4)。

注：利用Kimura 2-parameter模型進行N-J分析；LZ-2012 SXL1 JN601676.1 Cryptosporiopsis sp. 后被定名為Cryptosporiopsis citricarpa [1]，再被更名為Pseudofabraea citricarp [5]。圖4 重慶萬州疑似柑桔輪斑病樣品5株分離菌株基于ITS1/ITS4序列的系統進化樹

2.3 分離菌株的致病性采用無傷處理接種時，離體葉片、枝條和果實上無病斑形成。在所有致傷處理接種的離體材料上，均可形成明顯病斑。由此推測，該病原菌是通過傷口侵染植物。在葉片上，正面針刺10針接種形成的病斑最大，反面2針接種形成的病斑最小。枝條去皮接種后，去皮處產生明顯的褐色病斑。果實去皮接種后，沿著去皮部位四周會形成透明水浸狀不規則的病斑，不向海綿層擴展。采用針刺10針致傷接種的果實，針刺處及其四周微微向內凹陷，果實表皮形成圓形深褐色病斑，手按壓明顯感覺果斑處變硬，切開病斑表層，可見果實海綿層褐變。

WZ1菌株對萬州地區規模種植的8個柑桔品種的葉片、枝和果均有致病性。接種12 d時，不同品種和不同組織材料之間的致病性均存在明顯差異。WZ1菌株接種12 d后，葉片上的病斑直徑以塔羅科血橙、W·默科特桔橙、紐荷爾臍橙顯著大于其他品種，枝條上的病斑直徑以W·默科特桔橙等6個品種顯著大于紅桔和紐荷爾臍橙，果實上的病斑直徑以塔羅科血橙顯著大于其他7個品種。塔羅科血橙在葉、枝和果實上的病斑均較大，是最易受害的品種(見表1)。

表1 WZ1菌株對8個柑桔品種不同離體材料的致病性 mm

菌株WZ1接種在昭通蘋果和碭山酥梨果實上4 d后，出現圓形深黑褐色偏棕病斑(圖5)，病斑向內微凹陷，輕按病斑處發現果實質地變得軟，果皮易破，果實剖面可見明顯U型腐爛。病斑會持續擴大，8 d時，碭山酥梨上病斑直徑達9.49 mm，昭通蘋果上病斑直徑為3.76 mm。

圖5 WZ1菌株對蘋果(左)和梨(右)果實的致病性(接種4 d)

2.4 常見殺菌劑對WZ1菌株的毒力供試殺菌劑對WZ1的菌絲生長均有一定程度的抑制作用(見表2)。EC50值小于3 mg/kg且EC90值小于50 mg/kg的殺菌劑有以下10種：450 g/L咪鮮胺 EC、50%甲基硫菌靈 SC、30%堿式硫酸銅 SC、50%啶酰菌胺 WG、11.5%吡唑嘧菌脂 EC、86.2%氧化亞銅 WP、50%醚菌酯WP、3%噻霉酮 ME、40%腈菌唑WP、99%噁霉靈 DP。這些殺菌劑對菌株WZ1的毒力較強，且長期、多次使用，菌株也不易產生耐藥性。EC50值小于3 mg/kg，但EC90值大于50 mg/kg的殺菌劑有以下6種：37%苯醚甲環唑 WP、60%唑醚·代森聯 WP、25%嘧菌酯 SC、250 g/L戊唑醇 EW、75%肟菌·戊唑醇 WG、12.5%烯唑醇 WP。如果長期、多次使用這些殺菌劑，菌株可能會產生耐藥性。46%氫氧化銅 WP、70%丙森鋅 WP、80%克菌丹 WP、80%代森錳鋅 WP、65%代森鋅 WP的EC50值在10 mg/kg和40 mg/kg之間，99%礦物油EC的EC50值大于200 mg/kg。這幾種殺菌劑不及其他藥劑效果理想，但也對菌株存在抑制作用，可用于保護嫩梢幼葉。

表2 供試殺菌劑對Pseudofabraea citricarpa WZ1菌株的室內毒力

為了提高藥劑對菌株的敏感性，降低菌株產生抗性的風險，減少用藥量，進行了殺菌劑復配篩選。試驗結果看出，80%代森錳鋅 WP分別與50%啶酰菌胺 WG、37%苯醚甲環唑WP復配使用時，EC50值均小于1.2 mg/kg。其中，80%代森錳鋅 WP與50%啶酰菌胺 WG 1∶64復配效果最佳，EC90值為7.11 mg/kg。80%克菌丹 WP與37%苯醚甲環唑 WP 1∶1復配也可以達到類似的效果，EC50值和EC90值分別為0.17和13.79 mg/kg。冬季清園時，植株會有大面積的創口，防控需同時使用清園保護藥劑和殺菌劑。99%礦物油 EC和80%代森錳鋅 WP 1∶50復配使用時，EC50值和EC90值分別為10.81和6 487.41 mg/kg(見表3)。

表3 復配藥劑對P. citricarpa WZ1菌株的室內毒力

3 討論

柑桔輪斑病最初在陜西城固的溫州蜜柑和金柑上被發現，2012年被首次報道[1-2]。柑桔輪斑病的病原菌主要侵染柑桔植株的葉和枝，造成患病柑桔大量枯葉、枯枝、落果，嚴重時會造成果園毀園，帶來巨大的經濟損失[1]。柑桔輪斑病的病原最初被鑒定為擬隱殼孢屬的一個新種，并被命名為CryptosporiopsiscitricarpaL. Zhu, K. D. Hy de & H.Y. Li[1]，2014年林惠嬌等[4]根據分子生物學數據將該病原菌歸入Neofabraea屬，2016年Chen等[5]將其更名為Pseudofabraeacitricarp。2018年，基于SCAR標記的P.citricarp快速鑒定法被開發出來[8]。2019年，P.citricarpa轉錄組學和蛋白組學數據分析結果被報道[9]。本試驗通過對患病柑桔樣品進行鑒定，確定重慶萬州地區近年新發生的疑似柑桔輪斑病的致病菌為Pseudofabraeacitricarpa，園區大面積發生的就是柑桔輪斑病。自2012年報道在陜西城固縣的溫州蜜柑和金桔上發現柑桔輪斑病后[1-2]，這是首次在新地區、新品種上的鑒定報道。病原菌的鑒定結果顯示，從萬州分離得到的柑桔輪斑病菌株和陜西城固的菌株在形態和分子序列[1-2]上均有差異；致病性測試結果顯示，重慶菌株對柑桔枝、葉、果均有致病性，與陜西菌株[1-2]有所不同。

室內離體測試結果顯示，WZ1菌株可侵染萬州地區規模種植的8種柑桔的葉、枝和果。相比葉片和果實，菌株對枝條的致病性更強，在枝條上發病更快速、明顯。這也與田間的發病情況類似[1-3]。田間，枝條上著生葉片和針刺的部位病斑最多，且病斑會持續擴大，隨后葉片從基部向尖部開始枯萎，直至整枝枯萎、葉枯至掉落。離體尤力克檸檬不及田間尤力克檸檬發病嚴重，可能是因為園區內植株因感染黃化脈明病毒導致整個樹體衰弱[10-11]，接著柑桔輪斑病菌在弱樹上暴發。由此推測，植株患其他病害更易感染柑桔輪斑病，或者是感染柑桔輪斑病后，植株會多種病害一起發病。除了已確定患柑桔輪斑病菌的品種外，萬州的多種雜柑種植區內也發現了柑桔輪斑病。這表明萬州地區柑桔種植園有暴發柑桔輪斑病的風險。該病害一旦擴展，將會造成毀園，帶來不可逆轉的巨大損失。種植塔羅科血橙、W·默科特桔橙、紐荷爾臍橙的園區，尤其需要高度重視，做好防控準備。值得警惕的是，柑桔輪斑病菌除侵染柑桔外，還可侵染蘋果和梨。WZ1菌株在昭通蘋果上形成的病斑，與明孢盤菌屬引起的蘋果牛眼果腐病癥類似但又不同[12-14]，WZ1菌株在昭通蘋果和碭山酥梨上形成病斑的速度更快、病斑擴大更快、癥狀更明顯。

化學殺菌劑是目前田間防控柑桔輪斑病的主要方法[1-3]。2012年朱麗[1]研究發現，室內苯醚甲環唑和咪鮮胺對柑桔輪斑病菌有抑制效果。本試驗通過室內毒力測定試驗發現，甲基硫菌靈、噻霉酮、醚菌酯、腈菌唑、堿式硫酸銅、吡唑嘧菌脂、啶酰菌胺、氧化亞銅、噁霉靈等殺菌劑，或是代森錳鋅與啶酰菌胺復配、克菌丹與苯醚甲環唑復配，都對WZ1菌株生長有較好的抑制效果，可以進一步用于田間試驗。

柑桔輪斑病容易暴發成災，一旦在田間發現患病植株，應及時處理患病組織和噴灑殺菌劑。針對柑桔輪斑病菌低溫生長的特點，春、秋新梢抽發期是生產上進行防控的關鍵期。秋季應噴灑藥劑保護秋梢尤其是晚秋梢；冬季加強清園，修剪病枝并噴灑保護劑和殺菌劑；春季新梢抽發前噴灑殺菌劑降低病原菌基數。