江西省吉水縣柑桔黃龍病菌檢測

張凱東，強 遙，鄢明峰，賀 哲，虞凡霜，葉 瑩，蔣軍喜

(江西農業大學農學院，南昌， 330045)

柑桔黃龍病又稱柑桔黃梢病、柑桔青果病，是世界柑桔生產上極具毀滅性的病害，屬國內外重要檢疫對象[1]。該病廣泛分布于亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲的50余個國家和地區，在我國則分布于海南、廣東、廣西、福建、臺灣、云南、貴州、四川、浙江、江西和湖南11個省(自治區)[2]。柑桔黃龍病的病原包括韌皮部桿菌屬中3種細菌，即亞洲韌皮部桿菌(CandidatusLiberibacter asiaticus, CLas)、非洲韌皮部桿菌(C. Liberibacter africanus, CLaf)和美洲韌皮部桿菌(C. Liberibacter americanus, CLam)[3-5]，我國的柑桔黃龍病菌為CLas[6]。

江西柑桔黃龍病最初于1978年在贛州市的安遠、大余等縣發生，之后隨著柑桔苗木的頻繁調運和柑桔木虱的逐漸北移，該病已擴散蔓延到贛南的各縣市區，吉安的遂川、萬安、泰和3縣[7]，以及撫州的廣昌、南豐2縣[8]。近年來，在吉安的吉水縣也陸續出現了柑桔黃龍病的疑似病株。為了確診吉水縣柑桔黃龍病疑似病株的病原，我們采用PCR和序列測定技術進行了柑桔黃龍病菌檢測，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣品采集2019年12月從吉水縣6個柑桔園共采集10份疑似柑桔黃龍病癥狀葉片樣品和2份無癥但懷疑已感染葉片樣品帶回室內檢測，每份樣品分別來自不同的植株。樣品具體信息見表1，癥狀特征見圖1。

表1 在江西省吉水縣采集的柑桔黃龍病待測樣品的相關信息

注：各編號對應信息見表1。圖1 在江西省吉水縣采集的柑桔黃龍病待測葉片樣品

1.2 樣品總DNA提取采用Ezup柱式植物基因組DNA提取試劑盒，按其說明提取樣品總DNA。提取的DNA最后溶于50 μL Buffer TE中，并于-20 ℃冰箱保存備用。

1.3 PCR擴增引物根據文獻[9]，選用柑桔黃龍病菌亞洲種特異性引物A2/J5對病樣進行PCR檢測。5’端引物(A2)序列為：5’-TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3’；3’端引物(J5)序列為：5’-ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3’。擴增片段長度預計703 bp，為部分核糖體蛋白基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 PCR擴增及序列測定PCR反應總體系25 μL，包括A2/J5各1 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。反應程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環；最后一次循環后72 ℃延伸10 min。獲得的PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產物送往上海生工生物工程有限公司進行測序。用計算機分析軟件 DNAStar (Madison Wisconsin, USA) 處理所測序列，整理后的序列遞交到NCBI數據庫與已有序列進行同源性比較。

2 結果與分析

2.1 DNA提取及PCR擴增采用試劑盒法從待測的12個樣品和陰性、陽性樣品中，均提取到了高質量的基因組總DNA。以提取的DNA為模板，用亞洲黃龍病菌特異性引物A2/J5進行PCR擴增，結果從第5、7、8、9、11、12號樣品和陽性對照中擴增到符合預期大小約703 bp的條帶，而從其他6個樣品和陰性對照中均未擴增到相應的條帶(見圖2)。

注：M為DNA marker，1—12對應信息見表1，陰為健康植株擴增結果，陽為患病植株擴增結果。圖2 樣品PCR產物的1%瓊脂糖凝膠電泳

2.2 序列測定及同源性分析將出現擴增條帶的6個樣品(命名為JS-5、JS-7、JS-8、JS-9、JS-11和JS-12)的PCR產物送至上海生工生物有限公司進行測序，返回的測序結果經DNAStar拼接后得到長度為703 bp的序列(包含了兩端引物序列)。經DNAStar進行序列比對，這6個樣品的序列完全相同，序列已遞交至GenBank，登錄號為MT274584—MT274589。與GenBank中已有序列進行同源性比較，這6個樣品的序列與柑桔黃龍病亞洲種對應序列(基因登錄號：CP001677)的同源性均為100%。

3 討論

近年來，江西省吉水縣多個柑桔園的植株陸續出現葉片黃化和斑駁等疑似黃龍病的癥狀。為了明確該地區柑桔黃龍病的發生情況，利用PCR擴增和序列測定技術對采集的12份疑似黃龍病的樣品進行了病原檢測。結果，從6個樣品中檢測到柑桔黃龍病菌，表明吉水縣已有黃龍病發生。黃龍病的存在，對該縣的柑桔產業是個潛在的威脅，希望能引起當地有關部門的高度重視。

柑桔黃龍病的葉片癥狀有不對稱斑駁黃化、均勻黃化和缺素狀黃化3種類型，果實有紅鼻果等癥狀，通常認為葉片不對稱斑駁黃化和紅鼻果是柑桔黃龍病特有的癥狀并作為田間診斷黃龍病的依據[10-11]。在本研究中，呈現為不對稱斑駁黃化癥狀的葉片樣品均檢測出黃龍病菌，這印證了柑桔黃龍病葉片不對稱斑駁黃化癥狀確實具有特異性。