杧果細菌性角斑病菌對杧果酚類代謝的影響

李國平，鄭 磊，柳 鳳

(中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所/海南省熱帶園藝產品采后生理與保鮮重點實驗室/農業部熱帶果樹生物學重點實驗室，廣東湛江，524091)

杧果細菌性角斑病又名杧果細菌性黑斑病、杧果細菌性潰瘍病，是由柑桔黃單胞菌杧果致病變種Xanthomonascitripv.mangiferaeindicae(Xcm)引起的杧果生產上的主要病害。該病可為害杧果葉、莖、花和果實等大部分組織，如遇到高溫高濕或者臺風雨天氣，病害發生尤為嚴重。該病的最大特點是果實染病后，果面布滿斑點，失去商品價值，嚴重時可造成落果失收，且該病一旦發生即使利用化學農藥控制住其進一步蔓延，但染病果實面上的斑點卻無法去除，果實商品價值大打折扣，因此預防該病發生對杧果生產十分重要[1]。

次生代謝在寄主植物抵御微生物侵染過程中發揮著至關重要的作用，酚類物質是植物抗病反應的主要次生代謝生化物質。植物體內酚類物質的代謝是一個復雜過程，主要通過苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶等酶類催化苯丙烷代謝途徑合成木質素、類黃酮、植保素、醌類等物質[2-3]，這些物質參與植物自身細胞引起過敏性反應、氧化還原反應、木質化形成和對毒素的應激活性等生理過程[4-5]。研究表明，酚類物質的升高降低與植物抗性無明顯相關性，各種物質之間通過相關轉化從而協調作用[6-7]。本研究以細菌性角斑病高抗品種“紅杧6號”和高感品種“貴妃”杧為試材，通過比較人工接種病原菌后感病和抗病品種果實內酚類代謝的差異，旨在闡明Xcm侵染對杧果酚類代謝的影響，豐富杧果細菌性角斑病病理的基礎理論，為進一步研究病害發生的內在機制以及杧果細菌性角斑病的防控提供有價值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原菌編號Xcm003，由本實驗室分離自杧果細菌性角斑病典型癥狀的杧果果實，致病性測定具有強致病力，經形態學觀察、生理生化測定及全基因組測序鑒定為柑桔黃單胞菌杧果致病變種Xanthomonascitripv.mangiferaeindicae[8]。根據田間表型和室內離體接種病菌觀察的結果，選擇細菌性角斑病高抗品種“紅杧6號”和高感品種“貴妃”杧為供試杧果品種進行試驗。

1.2 試驗設計

試驗在本單位農業部隔離檢驗檢疫室內進行，選取健康生長的“紅杧6號”和“貴妃”杧1年生實生苗，每個品種5株，以搖床培養48 h后濃度約為4×106cfu/mL的Xcm003懸浮液作為接種體，采用刺傷接種法接種嫩葉(黃轉綠)，接種無菌水為對照，接種后保濕培養，分別在接種后12、24、48、96、144、192 h取樣，每次取樣隨機選取葉片5片，重復測定3次。

多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性測定參照李榮花等方法加以改進[9]。總酚、類黃酮相對含量測定參照Pirie等的方法，總酚相對含量用OD280/g·FW表示，類黃酮相對含量用OD325/g·FW表示[10]。阿魏酸相對含量參考邱永祥的方法并略有改進[11]，木質素相對含量參照翟艷霞的方法[12]測定。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2007 軟件和SPSS 10.0 for Windows軟件統計分析數據，采用Duncan’s(鄧肯氏)進行多重差異比較，p<0.05為差異具有顯著性。

2 結果與分析

2.1 多酚氧化酶活性變化

接種病菌后，杧果抗感品種葉片內多酚氧化酶活性變化見圖1。無論是抗病品種還是感病品種，接種病菌后多酚氧化酶活性均明顯高于其對照(無菌水)處理。感病品種“貴妃”杧接種48 h就達到頂峰，是其對照(無菌水)的1.8倍，隨后一直保持較高水平。“紅杧6號”接種病菌96 h前多酚氧化酶活性變化不明顯，與其對照(無菌水)無顯著性差異，但接種144 h后活性上升3～4倍，接種144 h“紅杧6號” 多酚氧化酶活性比其對照(無菌水)高2.6倍。綜合來看，感病品種應激反應較快，但是上升幅度低于抗病品種。

圖1 兩個杧果品種接種杧果細菌性角斑病菌后葉片多酚氧化酶活性變化

2.2 苯丙氨酸解氨酶活性變化

杧果抗感品種接種病菌后，葉片內苯丙氨酸解氨酶活性變化見圖2。“紅杧6號” “貴妃”杧葉片苯丙氨酸解氨酶活性均有所提高，在接種病菌48 h和144 h時達到各自峰值，分別為4 371 U/(g·min)和8 837.5 U/(g·min)，是其對照的2.0和6.3倍。綜合比較發現，接種病菌后抗感病品種苯丙氨酸解氨酶活性變化速度基本一致，但感病品種“貴妃”杧苯丙氨酸解氨酶活性升高的幅度較大。

圖2 兩個杧果品種接種杧果細菌性角斑病菌后葉片苯丙氨酸解氨酶活性變化

2.3 總酚相對含量的變化

從圖3中可以看出，接種病菌后杧果抗感病品種葉片內總酚相對含量較各自對照(無菌水)發生明顯變化，“紅杧6號”總酚相對含量呈現先上升后下降的趨勢，但是總體水平明顯高于其對照(無菌水)處理。感病品種“貴妃”杧接種病菌后前期(96 h前)與其對照(無菌水)無明顯差異，總酚相對含量呈下降趨勢。綜合分析可以初步推斷，總酚相對含量與杧果抗性呈正相關。

圖3 兩個杧果品種接種杧果細菌性角斑病菌后葉片總酚相對含量變化

2.4 類黃酮相對含量的變化

類黃酮因其具有殺菌和抑菌作用，因而在植物抗病反應中被廣泛關注。由表1可以看出，抗感品種對照(無菌水)處理的葉片類黃酮相對含量始終保持在一個穩定狀態，其中感病品種類黃酮相對含量高于抗病品種，取樣時段的平均值分別為99.46 OD325/g和76.78 OD325/g。接種病菌后，類黃酮在抗感品種中均發生明顯變化。抗病品種“紅杧6號”葉片中類黃酮相對含量迅速上升，12 h增幅41.33%，24～96 h期間增幅79%以上，144～192 h趨于穩定，但仍明顯高于清水處理。感病品種“貴妃”杧的類黃酮相對含量增幅不明顯，且后期顯著低于其對照(無菌水)。綜合分析可以推測，類黃酮相對含量變化與杧果抗性可能呈正相關。

表1 兩個杧果品種接種杧果細菌性角斑病菌后葉片類黃酮相對含量的變化

2.5 阿魏酸相對含量的變化

由表2可以看出，病菌侵染對杧果葉片中阿魏酸相對含量有明顯的影響，在抗病品種 “紅杧6號”中，阿魏酸相對含量呈現先增加后下降的趨勢，24 h增幅最大，為34.78%。感病品種“貴妃”杧阿魏酸相對含量與其對照(無菌水)相比，隨著時間的延長不斷的減少。抗病品種“紅杧6號”和感病品種“貴妃杧”對照(無菌水)的比較，阿魏酸相對含量較穩定，且差異不顯著。由此推斷阿魏酸相對含量與杧果的抗性可能呈正相關。

表2 兩個杧果品種接種杧果細菌性角斑病菌后葉片阿魏酸相對含量變化

2.6 木質素相對含量的變化

木質素作為植物細胞壁的主要成分，在植物抵御病菌侵染過程中起重要作用。由表3可以看出，抗病品種“紅杧6號”接種病菌后木質素相對含量有所提高，增幅最大值出現在接種病菌144 h，比對照增幅17.93%。感病品種“貴妃”杧在接種病菌后木質素相對含量變化緩慢，增長幅度約5%左右。綜合比較發現，病菌侵染后，抗病品種木質素相對含量提高幅度高于感病品種，可能通過增加細胞壁的厚度來抵御病菌侵入，從而達到抗病效果。

表3 兩個杧果品種接種杧果細菌性角斑病菌后葉片木質素相對含量變化

3 結論與討論

酚類化合物是植物體本身的固有成分，是植物體次生代謝產物中最重要的化合物之一，參與植物色素合成、生長發育、信號轉導、抗氧化機理和逆境防御等生化過程中。酚類化合物包括苯丙烷類、黃酮類、倍酸型、鞣花酸型、羥基芪類和單寧類等[3，13]。酚類化合物在植物抵御不良環境、病原物侵染的過程中起到重要的抗逆作用已引起廣泛關注，其主要通過合成抗性物質、抑制或殺死病原細胞和刺激寄主細胞產生抗性反應等方式來提高寄主的抗病能力[14]。咖啡受咖啡炭疽病菌侵染后，抗性品種在早期產生黃酮類、羥基肉桂酸衍生物等酚類物質，促使咖啡發生過敏性反應形成壞死斑和加速細胞壁的木質化增加細胞厚度，從而進一步阻礙病菌的蔓延[15]。唐永萍等以秦冠、富士、金冠蘋果果實為材料，通過損傷接種灰葡萄孢菌后發現，抗病蘋果品種通過調節果肉內酚類物質代謝，增強次生代謝能力，其中類黃酮和木質素含量的增加強化了果實的抗性反應，進而提高對灰霉病的抗性，但總酚含量與植物抗病性關系不大[16]。張云霞等為探尋甘藍抗黑腐病的生理生化機制，以抗病材料C7和感病材料C26為試驗材料，在甘藍幼苗期，噴施病菌懸浮液發現，抗病品種和感病品種苯丙氨酸解氨酶活性均先顯著增加后迅速下降，但抗病品種的酚類物質和木質素含量后期無明顯變化[17]。

本研究以杧果細菌性角斑病不同抗性杧果品種為材料，研究了接種病菌后杧果葉片內總酚、類黃酮、木質素相對含量及酚類代謝相關酶(苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶)活性的變化趨勢。結果表明，接種病菌后，感病品種“貴妃”杧和抗病品種“紅杧6號”內總酚、類黃酮、阿魏酸、木質素相對含量，苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶活性均直線上升，其中總酚、類黃酮、阿魏酸、木質素相對含量增幅在抗病品種中高于感病品種，且感病品種接種后期總酚和類黃酮相對含量均迅速降低；感病品種的苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶活性增幅較高。病菌侵染對杧果酚類代謝產生顯著影響，推測杧果葉片的總酚、類黃酮、阿魏酸、木質素相對含量與杧果抗性呈正相關，而苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶活性與抗病性呈負相關。由于植物抗病性是一個多體系混合作用的復雜機制，酚類物質代謝途徑與其他抗病機制如何協調互作有待進一步研究。