貴州修文獼猴桃潰瘍病菌遺傳多樣性分析

黃 露，譚清群，李添瓊，唐靖文，秦智慧，王國立，吳石平

(1 貴州省農業科學院植物保護研究所，貴陽，550009；2 貴州省修文縣農業局，貴州修文，550200；3 貴州省修文縣獼猴桃產業發展局，貴州修文，550200)

貴州自1988年起開始種植獼猴桃，目前種植面積已超過3.33萬hm2。修文縣2016年種植面積已達1.06萬hm2，且在不斷擴大，是貴州的獼猴桃主產區，但近幾年獼猴桃生產上受到病害的制約，其中，危害最大的是獼猴桃潰瘍病。獼猴桃潰瘍病是一種極具毀滅性的細菌性病害，病原菌為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)，其為害獼猴桃植株的枝干、葉片及花等部位，造成枝蔓、葉枯死，花蕾萎蔫脫落，果實干縮、脫落，整株枯死，造成果園大量減產，嚴重的甚至毀園[1-2]。新西蘭、意大利及我國陜西、四川等地的獼猴桃園，由于潰瘍病的爆發及流行，短時間內造成了巨大的經濟損失[3-5]。由于不同地區分離到的獼猴桃潰瘍病菌在致病力、抗藥性、生長狀況等生物學特性上差異較大，因此研究病菌的群體遺傳多樣性具有重要意義。Lee等[6]采用RAPD方法研究發現，日本及韓國的Psa具有不同的系統發育起源。Ferrante等[7]利用ERIC-PCR和BOX-PCR分析發現，意大利的Psa菌株與20世紀危害嚴重的Psa菌株表現出不同的指紋圖譜。有研究認為，Psa分為4個生物型，Psa1型病菌分布于日本、意大利，Psa2型病菌分布于韓國，Psa3型廣泛分布于歐洲、新西蘭、智利、中國，Psa4型僅在新西蘭和澳大利亞有分布[8-10]。Cunty等[11]通過4個基因(gapA、gltA、gyrB和rpoD)進行多樣性分析，發現Psa1、Psa2和Psa3在基因上有很大的相關性，且與Pseudomonassyringaepv.theae同源關系較近，而Psa4則與其同源關系較遠。高小寧等[12]通過Rep-PCR分析發現，陜西省獼猴桃潰瘍病菌基因組存在豐富的遺傳多樣性。目前，貴州修文獼猴桃潰瘍病菌還沒有系統性地進行分離鑒定及遺傳多樣性研究。本研究系統地對貴州修文的獼猴桃潰瘍病菌進行分離鑒定，并利用ERIC-PCR分析病菌群體的遺傳多樣性，可為病菌檢測、發生流行規律研判、抗病種選育和病害防控等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 獼猴桃潰瘍病菌分離材料 2016—2017年，在貴州修文多個貴長獼猴桃果園采集感染潰瘍病的獼猴桃枝條、葉片、花蕾等材料，進行潰瘍病菌的分離。

1.1.2 培養基 LB培養基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2，固體培養基則加入15 g/L的瓊脂，121 ℃滅菌20 min，用于獼猴桃潰瘍病菌的分離純化。

1.1.3 引物 細菌16S rDNA通用引物：27F: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1492R: 5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。ERIC引物：ERIC1：5’-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’，ERIC2：5’-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3’。所有引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.4 試劑和儀器 細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；無水乙醇、 異丙醇均為國產分析純等級；凝膠成像儀為Gel Doc-ItTMUVP凝膠成像系統；PCR儀為BIO-RAD。

1.2 方法

1.2.1 獼猴桃潰瘍病菌分離保存 采用平板劃線法進行分離。分別取感染潰瘍病的貴長獼猴桃枝條、葉片、花蕾等材料，用75%酒精和2%次氯酸鈉溶液進行表面消毒，用滅菌去離子水洗3次，取少量病健交界處的組織轉移到含有0.5 mL無菌生理鹽水無菌培養皿中，靜置10～15 min，形成細菌懸浮液。采用滅菌移植環蘸取少量懸浮液在LB平板培養基上劃線，28 ℃培養48 h，觀察結果，并挑取單菌落在LB培養基上轉接純化2～3次后，-80 ℃保存[13]。

1.2.2 獼猴桃潰瘍病菌16s rDNA鑒定 分離到的病菌用細菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。對提取的樣品DNA進行16s rDNA擴增測序。PCR反應體系(25 μL)包括：9.5 μL ddH2O，12.5 μL PCR Mix，1 μL 27F/1492R引物(10 mmol·L-1)，1 μL模板DNA。PCR循環參數為：95 ℃熱變性10 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃延伸10 min；最后在4 ℃停止反應[14]。采用質量分數1.2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，并將有條帶的PCR產物送樣測序。將測序結果進行Blast比對，采用BioEdit軟件對從NCBI數據庫中獲取的可信度較高的相似序列進行多序列比對，然后用MEGA 6.0軟件進行系統發育樹構建和聚類分析。

1.2.3 獼猴桃潰瘍病菌ERIC-PCR多態性分析 使用Rep-PCR引物ERIC1/ERIC2對分離菌株基因組DNA進行擴增分析。25 μL PCR 反應體系如下：9.5 μL ddH2O，12.5 μL PCR Mix，1 μL ERIC1/ERIC2引物(10 μmol·L-1)，1 μL模板DNA。PCR循環參數為：95 ℃預變性7 min；94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，65 ℃ 8 min，共35個循環；65 ℃延伸15 min。采用質量分數2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，上樣量10 μL，電壓100 V，電泳90 min，用Gel Doc-ItTMUVP凝膠成像儀拍攝[12]。使用Quantity One對電泳圖片進行分析，以2進制統計各引物對所有樣品的擴增條帶，有條帶記1，無條帶記0。使用軟件NTSYS Version 2.1中的Similarity法計算相似系數，使用軟件SAHN Clusteringz中的UMPGA方法進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃潰瘍病菌分離

通過對貴州修文感染潰瘍病的貴長獼猴桃枝條、葉片、花蕾等材料進行獼猴桃潰瘍病病原菌分離，共分離到35株病菌(見表1)。

表1 貴州修文分離到的獼猴桃潰瘍病菌菌株

2.2 獼猴桃潰瘍病菌16S rDNA鑒定

分析結果顯示，35株分離病菌的16S rDNA序列與NCBI網站上的Psa菌株的同源性達到99%，在構建的系統發育樹上，35株細菌均與Psa聚在一支(見圖1)。說明，35株分離的獼猴桃潰瘍病病原菌為Pseudomonassyringaepv.actinidiae。

圖1 貴州修文獼猴桃潰瘍病分離菌株基于16S rDNA序列的系統發育樹

2.3 獼猴桃潰瘍病菌ERIC-PCR多態性分析

對分離到的35株病菌進行ERIC-PCR引物擴增，大小片段100～2 000 bp之間(見圖2)。聚類分析結果顯示，在相似系數為0.808時，可將分離到的35株病菌分為4個不同的類群，有30株(占85.7%)屬于第一類群，同一器官(如葉片)分離到潰瘍病菌可分散在不同類群中，同一地區采集分離到的病原菌也可分散在不同類群中(見圖3)。表明，修文獼猴桃潰瘍病菌遺傳多樣性豐富。

圖2 貴州修文獼猴桃潰瘍病分離菌株ERIC-PCR擴增結果

圖3 貴州修文獼猴桃潰瘍病分離菌株基于ERIC-PCR的聚類分析結果

3 小結

在本研究中，對貴州省修文縣貴長獼猴桃感染潰瘍病的枝條、葉片、花蕾等材料進行病菌分離，分離到35株病菌，進行細菌16S rDNA鑒定，均為Pseudomonassyringaepv.actinidiae；運用ERIC-PCR分析病菌群體的遺傳多樣性，在相似系數為0.808時，所有菌株可分為4個類群，85.7%的菌株屬于第一類群，同時無明顯的采集地、采集部位聚類現象，表明貴州貴長獼猴桃潰瘍病菌存在豐富的遺傳多樣性。但本研究只在修文縣采集了一個獼猴桃品種(貴長)的潰瘍病菌進行遺傳多樣性分析，代表程度有局限性，以后的研究應加大采樣品種及地區數量，以便更好地闡明貴州獼猴桃潰瘍病病菌遺傳多樣性。