昭通蘋果早期落葉病葉中一種新病原菌的發(fā)現(xiàn)研究

鄧 瀟，陳 宇，馬仲煉，黃先敏

(昭通學(xué)院農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南昭通，657000)

蘋果早期落葉病是指蘋果樹在生長(zhǎng)季節(jié)非正常大量落葉病害的統(tǒng)稱[1]。早期落葉病是昭通蘋果產(chǎn)區(qū)的主要病害，發(fā)病普遍，危害嚴(yán)重[2]。據(jù)報(bào)道，早期落葉病有蘋果斑點(diǎn)落葉病、褐斑病、灰斑病及圓斑病4種類型。早期落葉病影響幼樹適齡結(jié)果及早期生產(chǎn)，削弱樹勢(shì)、降低果實(shí)產(chǎn)量及品質(zhì)等[3]。斑點(diǎn)落葉病是由蘋果鏈格孢菌(AlternariamaliRoberts)引起，病原菌屬半知菌亞門真菌，侵染蘋果葉片，引起早期落葉病[4]。斑點(diǎn)落葉病葉上病斑近圓形，灰褐色，有輪紋，上生子實(shí)體[5]。蘋果褐斑病是由蘋果盤二孢菌(Marssoninamali)引起，病斑近圓形，褐色或紫褐色，邊緣不明顯，造成樹葉早落[6]。蘋果灰斑病由梨葉點(diǎn)霉菌(PhyllostictapyrinaSacc.)引起[7-8]，葉片上形成黃色至灰色的病斑，在成熟的葉片上多呈近圓形壞死斑，病斑上散生的黑色小點(diǎn)，是病菌的分生孢子器[9-10]。蘋果圓斑病是一種高等真菌性病害，由孤生葉點(diǎn)霉(Phyllostictasolitaria)引起，葉片受害形成褐色圓斑[11-12]。

至今報(bào)道，引起蘋果早期落葉病的病原菌有：蘋果盤二孢菌、蘋果鏈格孢菌、梨葉點(diǎn)霉菌及孤生葉點(diǎn)霉菌4種病原菌。除去這4種病原菌，還未曾見有過(guò)其他引起早期落葉病病原菌的報(bào)道。2019年10月，作者在云南省昭通市舊圃鎮(zhèn)大村的一個(gè)蘋果園中，發(fā)現(xiàn)了該園中的許多蘋果樹感染了早期落葉病。采集其中感病最為嚴(yán)重的4株蘋果樹的病葉帶回實(shí)驗(yàn)室，從中分離純化出一種新的病原菌。本試驗(yàn)從病原菌的分離純化[13]、培養(yǎng)特性、顯微結(jié)構(gòu)觀察[14]及柯赫氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定[15]等方面，確定所分離純化出的病原菌是蘋果葉部病害上新的病原菌，該試驗(yàn)結(jié)果可為蘋果早期落葉病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

蘋果早期落葉病葉采自云南省昭通市舊圃鎮(zhèn)大村蘋果園，果園地處三面環(huán)山的山谷，蘋果品種為紅富士，樹齡24年。選擇園中患病最為嚴(yán)重的4株蘋果樹，每株病樹按東、南、西、北4個(gè)方向采摘病葉，每個(gè)方向采摘病葉6片，共計(jì)96片病葉。柯赫氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定所用接種蘋果樹為兩年生盆栽紅富士蘋果樹。

1.2 試驗(yàn)方法

采用常規(guī)組織分離法、稀釋涂布法及劃線純化法，對(duì)蘋果早期落葉病葉中的病原菌進(jìn)行分離和純化。采用插片法制作病原菌涂片，用CX40生物光學(xué)顯微鏡對(duì)病原菌的結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。按照柯赫氏法則進(jìn)行致病性測(cè)定。

1.2.1 病原菌的分離純化

將從果園采回的早期蘋果落葉病葉剪碎，稱取剪碎病葉10 g，放入盛90 mL無(wú)菌水的三角燒瓶中，用超聲波清洗器振蕩約5 min，使病葉組織中的病原菌充分分離出來(lái)，均勻分散在無(wú)菌水中。然后在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)，用移液器吸取1 mL液體，加入盛有9 mL無(wú)菌水的試管中，充分混勻。再用移液器從此試管中吸取1 mL病葉組織液，加入另一盛有9 mL無(wú)菌水的試管中，混合均勻。以此類推，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同稀釋濃度的植物病葉組織懸液。

用移液器分別吸取稀釋梯度為10-3、10-4和10-5的蘋果落葉病葉懸液1 mL，放入PDA培養(yǎng)基平板中，每一種稀釋梯度做3個(gè)重復(fù)。再用無(wú)菌涂布棒將病葉懸液沿同心圓輕輕地向外擴(kuò)展，涂抹均勻，靜置10 min。然后將平板倒置于溫度28 ℃、濕度80%的人工氣候箱中培養(yǎng)。

經(jīng)過(guò)20 h后，PDA平板上長(zhǎng)出直徑約2 cm的菌落，挑取單個(gè)菌落，用劃線接種法接種于PDA平板上進(jìn)一步純化培養(yǎng)，對(duì)分離得到的菌株，再進(jìn)一步做試管斜面純化，得到純化的病原菌菌株。

1.2.2 病原菌的顯微制片

用插片法對(duì)病原菌進(jìn)行顯微制片，將消毒滅菌后的蓋玻片以45°的斜角插入PDA平板中，再將純化好的病原菌用接種環(huán)刮取病原菌后，接種環(huán)在培養(yǎng)基與蓋玻片的交界處劃線。將平板倒置于溫度28 ℃、濕度80%的人工氣候箱中培養(yǎng)觀察，經(jīng)培養(yǎng)2 d后，菌絲長(zhǎng)滿平板，將蓋玻片用無(wú)菌鑷子取出，制作臨時(shí)裝片，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病原菌的結(jié)構(gòu)觀察。

1.2.3 病原菌接種蘋果葉片

將純化好的病原菌采用柯赫氏法則進(jìn)行回接致病性試驗(yàn)。室外試驗(yàn)，時(shí)間是6月的中、下旬，溫度在15～29 ℃，平均相對(duì)濕度在49%～83%。在純化好的病原菌試管中，加入無(wú)菌水9 mL后，用接種環(huán)輕輕刮病原菌，制成病原菌懸浮液備用。用75%酒精把2年生盆栽紅富士蘋果樹葉擦拭干凈，再用無(wú)菌水沖洗干凈。用無(wú)菌接種針在樹葉上扎成直徑約5 mm的傷口，在傷口處涂抹上病原菌懸浮液。每株樹的4個(gè)方向分別選擇6片樹葉做有傷接種，同時(shí)以無(wú)菌水用上述同樣的方法接種葉片作為對(duì)照，進(jìn)行觀察比較。

1.2.4 接種病原菌感病葉片中的病原菌

分離純化及顯微觀察

將純化出的病原菌接種蘋果樹葉后，采摘感病葉片參照步驟2.2.1進(jìn)行分離純化；參照步驟2.2.2制作病原菌的顯微圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的培養(yǎng)特性

將純化好的病原菌，接種在PDA培養(yǎng)基上，觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。試驗(yàn)結(jié)果看出，病原菌接種PDA后，經(jīng)過(guò)9 h，在PDA平板上長(zhǎng)出肉眼可見的淡白色菌落，直徑1 cm。18 h時(shí)，培養(yǎng)基上菌落變大，直徑約2 cm，呈白色，長(zhǎng)出絨毛狀菌絲。培養(yǎng)基背面無(wú)明顯變化。23 h時(shí)，菌落直徑3 cm，白色絨毛狀菌絲長(zhǎng)約1 mm，接種點(diǎn)處變?yōu)榛疑囵B(yǎng)基背面中央為白色。26 h時(shí)，菌落直徑4 cm，菌落邊緣白色絨毛狀菌絲匍匐于培養(yǎng)基上，寬約1 cm，中央直立菌絲長(zhǎng)約2 mm，培養(yǎng)基背面中央白色加深。32 h時(shí)，菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)平板，中央直立菌絲抵達(dá)皿蓋，周圍菌絲較矮，匍匐于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基背面中央白色面積擴(kuò)大。40 h時(shí)，菌絲由白色變成淺褐色，培養(yǎng)基背面由白色變成淺灰色。46 h時(shí)，菌絲呈現(xiàn)灰色或褐色，培養(yǎng)基背面為灰色或淺黃色(見圖1)。

圖1 病原菌的培養(yǎng)特征(A為正面，B為反面)

2.2 病原菌的顯微觀察

采用插片法，使病原菌長(zhǎng)在蓋玻片上，做成臨時(shí)裝片。在CX40顯微鏡下進(jìn)行觀察，可得病原菌的顯微結(jié)構(gòu)圖(見圖2)。

從圖2中可以看出，在40倍和100倍顯微鏡下，該病原菌的結(jié)構(gòu)完整，菌絲為無(wú)隔膜菌絲，具有假根和匍匐枝，假根相對(duì)處向上長(zhǎng)出孢囊梗，2根孢囊梗簇生在一起(圖2-A、B)。在200倍下，孢囊梗單生，不分枝，頂端產(chǎn)生孢子囊。孢子囊球形，囊軸明顯，基部有囊托，內(nèi)有大量孢囊孢子(圖2-C)。在400倍下，孢囊孢子球形、卵形或不規(guī)則形，有棱角，表面有線紋，無(wú)色至淡褐色(圖3-D)。

A：40倍顯微鏡下的病原菌結(jié)構(gòu)圖；B：100倍顯微鏡下的病原菌結(jié)構(gòu)圖；C：200倍顯微鏡下的孢囊梗和孢子囊；D：400倍顯微鏡下的孢囊孢子圖2 早期蘋果落葉病葉中分離出的病原菌的顯微結(jié)構(gòu)

2.3 病原菌侵染葉片過(guò)程觀察

根據(jù)柯赫氏法則，將純化的病原菌菌株進(jìn)行回接試驗(yàn)，觀察病原菌對(duì)蘋果樹葉的感染情況，以無(wú)菌水作為對(duì)照。結(jié)果見圖3。

從圖3中可以看出，病原菌接種到樹葉后，樹葉的感染過(guò)程為：在接種初期，樹葉無(wú)明顯癥狀，到接種86 h后，接種樹葉出現(xiàn)長(zhǎng)度為0.5 cm的不規(guī)則形病斑，病斑為褐色，病、健部分界明顯(圖3-C)。接種96 h后，病斑擴(kuò)大，形狀不規(guī)則，直徑1 cm左右，病斑為褐色，病、健部分界明顯(圖3-D)。接種108 h后，病斑擴(kuò)大至葉面積的1/4，形狀不規(guī)則，病斑中央顏色為紅褐色，邊緣為紫褐色(圖3-E)。接種132 h后，病斑不再擴(kuò)大，病斑直徑2～3 cm，顏色為棕色至褐色，形狀不規(guī)則，邊緣顏色較深，病斑干燥易破裂(圖3-F)。以無(wú)菌水做對(duì)照的試驗(yàn)組，從接種無(wú)菌水到132 h，在樹葉上均未出現(xiàn)任何癥狀，同時(shí)，用接種環(huán)在樹葉上劃的傷口已愈合。

A—B:對(duì)照組，接種0.05 mL無(wú)菌水；C—F:試驗(yàn)組，接種0.05 mL病原菌菌懸液圖3 病原菌侵染蘋果葉片癥狀

將從蘋果園中采集的早期落葉病葉中分離、純化的病原菌菌種，轉(zhuǎn)接到蘋果樹葉上，能夠感染蘋果葉片，受感染的樹葉癥狀與田間采回病葉的癥狀一致。

2.4 接種感病葉片中病原菌的顯微結(jié)構(gòu)

將接種病原菌后感病葉片進(jìn)行組織分離，獲得病原菌。采用插片法使病原菌長(zhǎng)在蓋玻片上，制成臨時(shí)裝片，進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察，結(jié)構(gòu)如圖4。

從圖4中可以看出，從轉(zhuǎn)接病原菌葉片中分離出的病原菌結(jié)構(gòu)，與從果園中采集病葉中分離的病原菌顯微結(jié)構(gòu)一致。菌絲為無(wú)隔菌絲(圖4-B、C)，具有假根和匍匐枝(圖4-A)，孢囊梗與假根相對(duì)生長(zhǎng)。孢囊梗單生，不分枝，頂端產(chǎn)生孢子囊。孢子囊球形，囊軸明顯，基部有囊托，內(nèi)有大量孢囊孢子，孢囊孢子球形、卵形或不規(guī)則形，有棱角。可見，接種后與果園采集的病原菌是同一種病原菌。

A：40倍顯微鏡下病原菌的結(jié)構(gòu)圖；B：100倍顯微鏡下病原菌的結(jié)構(gòu)圖；C：200倍顯微鏡下病原菌的孢囊梗、孢子囊及孢囊孢子圖4 從轉(zhuǎn)接病原菌蘋果葉片上分離出的病原菌顯微結(jié)構(gòu)

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)從蘋果早期落葉病葉中分離、純化出的病原菌，在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性是，28 ℃時(shí)，在PDA培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)，32 h時(shí)即長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，先為白色，后變淺褐色至黑色。反面起先白色，后變成灰白色。匍匐菌絲起先白色，后變褐色。顯微結(jié)構(gòu)為具有假根和匍匐枝，假根分枝多，發(fā)育良好。孢子囊柄直立，不分枝，褐色，2枝簇生，長(zhǎng)在假根對(duì)側(cè)，菌絲無(wú)分隔，細(xì)胞壁平滑。孢子囊球形，囊軸明顯，基部有囊托，內(nèi)有大量孢囊孢子，孢囊孢子數(shù)量多，呈球形、卵形或不規(guī)則形，有棱角，表面有線紋，無(wú)色至淡褐色。參照陸家云的《植物病害真菌學(xué)》及陳江華的文獻(xiàn)[5,16]，可以確定本試驗(yàn)中，從早期落葉病葉中分離出的病原菌為匍枝根霉菌(Rhizopusstolonifera)。關(guān)于匍枝根霉侵染、危害植物果實(shí)有過(guò)報(bào)道[17]，而對(duì)植物葉片的侵染危害，還未曾見有過(guò)報(bào)道。

報(bào)道引起蘋果早期落葉病的病原菌有：引起斑點(diǎn)落葉病的蘋果鏈格孢菌，引起蘋果褐斑病的蘋果盤二孢菌，引起蘋果灰斑病的梨葉點(diǎn)霉菌和引起蘋果圓斑病的孤生葉點(diǎn)霉。早期落葉病葉中有匍枝根霉病原菌的報(bào)道還未曾見有過(guò)。蘋果鏈格孢菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 d后，接種點(diǎn)的邊緣有青褐色菌絲長(zhǎng)出。培養(yǎng)3 d后，產(chǎn)生大量分生孢子，呈倒梨形、近卵狀，具橫隔，分生孢子鏈細(xì)長(zhǎng)。7 d后，長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，呈圓形。菌落中央黑色，外部青褐色，邊緣色淺。氣生菌絲較短，可見褐色粉狀物[18]。在PDA 平板上，蘋果盤二孢病菌生長(zhǎng)緩慢，菌落近圓形，隆起，黑色至黑褐色，表面不光滑，呈蚯蚓糞狀，無(wú)氣生菌絲，邊緣不規(guī)則，觀察不到子實(shí)體和基內(nèi)菌絲。蘋果褐斑病葉葉片變黃易脫落，病、健交界處不明顯[19]。蘋果灰斑病的病原菌為梨葉點(diǎn)霉菌，其分生孢子無(wú)色、單胞，內(nèi)含一個(gè)油球，聚集在一起時(shí)呈淡黃色[5]。蘋果圓斑病的病原菌為孤生葉點(diǎn)霉，菌落正面墨綠色或灰白，反面墨綠色，近似圓形，全緣，稠密，中央氣生菌絲發(fā)達(dá)，灰色。分生孢子器球形或橢圓形，上端具1孔口，深褐色；分生孢子單胞、無(wú)色，橢圓形或卵形，內(nèi)具透明狀油點(diǎn)[6]。可見，該試驗(yàn)所分離出來(lái)的病原菌是與以往不同的一種病原菌。

通過(guò)常規(guī)組織分離、柯赫氏法則驗(yàn)證及病原菌的鑒定(培養(yǎng)特性和顯微結(jié)構(gòu))，證實(shí)從蘋果早期落葉病葉中分離出來(lái)的病原菌是匍枝根霉菌，匍枝根霉感染蘋果落葉病的報(bào)道未曾見到，這是首次發(fā)現(xiàn)存在蘋果落葉病葉中的病原菌——匍枝根霉，該發(fā)現(xiàn)可為蘋果早期落葉病的防治提供依據(jù)。