人參總皂苷對大鼠骨關節炎的作用

包黎莎 王華芳 楊錦熒 王春雷 單樂天*

骨關節炎（OA）是一類軟骨丟失、破壞、關節四周骨質增生為特征的與年齡相關的慢性疾病，可同時累及滑膜、軟骨下骨和關節周圍軟組織，常見臨床表現為膝骨關節腫脹感，僵硬不適，進展性膝關節疼痛，最終關節活動受限，甚至失用［1］。膝骨關節炎總患病率15%，隨年齡的增長呈明顯遞增趨勢［2-3］。中醫將OA歸屬“骨痹”“痛痹”等范疇，中醫病機為肝腎虧虛加之外邪侵襲，造成風寒濕熱和瘀血痹阻。《本草綱目》記載人參具有治療痹癥的作用，因其療效廣泛副作用低［4-5］，是經典強壯滋補藥物。人參總皂苷（TSPG）是人參中最重要的藥理成分，現代醫學研究表明，其具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物活性［6］。本文探討人參總皂苷對骨關節炎大鼠關節疼痛和軟骨修復的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雌性SPF級SD大鼠50只，體質量（200±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物合格證號：SCXK（滬）2013-0016。在浙江中醫藥大學動物實驗中心進行，實驗方案通過醫學動物實驗倫理委員會批準。

1.2 儀器及試劑 人參總皂苷；碘乙酸（MIA，Sigma公司，批號：BCBL3682V）；戊巴比妥鈉，EDTA脫鈣液（Solarbio）；YLS-3E電子壓痛儀（安合盟天津科技發展有限公司）；37370足底熱輻射測痛（UGOBASILE）。

1.3 方法 （1）人參總皂苷溶液的配制：取人參總皂苷（TSPG）成品試劑（上海源葉生物有限公司），溶于超純水，分別配置成125 μg/ml、250 μg/ml、500 μg/ml的溶液。（2）大鼠分組、造模及藥物干預：取SPF級雌性SD大鼠50只，隨機分為人參總皂苷高濃度組（TSPG-H 500 μg/ml）、人參總皂苷中濃度組（TSPG-M 250 μg/ml）、人參總皂苷低濃度組（TSPG-L 125 μg/ml）、模型組（Model組）和空白對照組（NC組），每組各10只。空白組大鼠通過微量注射器向其雙側膝關節內各注射50 μl生理鹽水，其余四組大鼠各注射25 μg/ml碘乙酸50 μl進行造模處理。造模后第7天測定大鼠壓痛閾值和熱痛閾值，與初始壓痛閾值、熱痛閾值比較，差異有統計學意義后，開始藥物干預。TSPG-H組、TSPG-M組、TSPG-L組分別關節腔注射500 μg/ml、250 μg/ml、125 μg/ml人參總皂苷水溶液，模型組和空白對照組雙側膝關節注射等量生理鹽水，1次/周，共4周。（3）大鼠壓痛閾值測定：于造模后每周用YLS-3E電子壓痛儀測定各組大鼠的壓痛閾值。測定時，將大鼠前肢和上半身以適宜力道固定，使其處于舒適且被固定的狀態，將壓痛儀的扁形頭在大鼠雙側后足足背拇趾根平齊處施壓，壓力逐漸增大，當大鼠出現明顯掙扎或鳴叫時，顯示的壓力值即為其壓痛閾值。（4）大鼠熱痛閾值測定：造模后每周采用足底熱輻射測痛儀測定各組大鼠雙側后足趾熱痛閾值。測定時將大鼠置于透明且大小合適的箱內（恰好容納大鼠且其不可大范圍活動）。測定前等待大鼠停止梳理毛發和探索性活動，保持安靜（期間要注意保持大鼠足底干燥）。將測試儀置于玻璃板下，將儀器上的“十”字形標對準大鼠后足底中央（避開足墊）。開啟儀器，從開始加熱至大鼠出現抬腿回避的時間即為大鼠熱痛閾值。每只大鼠測定3次，間隔5～6 min/次，取平均值作為測量值。（5）大鼠膝關節軟骨組織病理學觀察：藥物干預完成后，處死所有大鼠，取其雙側膝關節，置于4%多聚甲醛中固定72 h，流水徹底沖洗。隨后加入EDTA脫鈣液對大鼠膝關節進行脫鈣，每天更換脫鈣液體并觀察脫鈣程度。脫鈣完成后，常規操作脫水、包埋、切片，進行HE染色，封片。光鏡下觀察軟骨組織病理學改變。并參照OARSI關節軟骨病理評分標準進行積分統計（見表1）。OARSI評分越高，提示骨關節病變越嚴重。（6）軟骨細胞實驗：①軟骨細胞分離和培養：采用膠原酶消化法提取。取新生大鼠5只，脫頸處死后，剃去毛發，于75%酒精中浸泡5 min徹底消毒大鼠體表。無菌操作取大鼠雙側膝關節，剃除膝關節表面肌肉組織（操作時應避免暴露關節腔），取出的膝關節在75%酒精中浸泡5 min后用手術刀打開關節腔，取出軟骨組織，以PBS緩沖液漂洗以充分洗去軟骨組織中殘留的結締組織。隨后將軟骨剪成小碎片，大小約為1 mm3，再次置于PBS緩沖液中漂洗3次后，棄去PBS，加入0.2% Ⅱ型膠原酶3 ml。振蕩搖勻使組織塊與Ⅱ型膠原酶充分接觸，放入37℃恒溫震蕩箱中消化40 min，取上層消化液進行離心，轉速800 r/min，離心5 min，棄上清液，取沉淀物（即細胞），加入4 ml含10%胎牛血清的DMEM培養液，吹打、混勻，得到軟骨細胞懸液。所得懸液用濾網過濾并計數，調整懸液密度為2×105/ml接種于25 cm2規格的培養瓶中，置于CO2培養箱中，37℃，5%CO2，培養24 h后用倒置顯微鏡觀察細胞貼壁情況。②軟骨細胞CCK實驗：取原代軟骨細胞，以每孔100 μl細胞懸液接種至96孔板中，即每孔5×103個細胞。將培養板放在培養箱中，在37℃，5% CO2環境中預培養24 h；移除96孔板中IMDM培養液，隨機分為正常組、模型組和實驗組，每組設5個復孔，正常組加入IMDM培養液，模型組每孔加入MIA（0.75 ng/ml）100 μl，實驗組每孔加入MIA后，再分別加入低、中、高不同濃度人參總皂苷水溶液100 μl（125，250，500 μg/ml），置培養箱中孵育；48 h后，每孔加入10 μl CCK溶液，置培養板于培養箱內孵育2 h后，用酶標儀測定孔內懸液在450 nm處的吸光度（A450），根據公式得出細胞活力，以檢測不同濃度的人參總皂苷水溶液對軟骨細胞增殖的影響，重復測量3次。細胞增殖率計算公式為：細胞增值率（%）=（實驗組平均A450值-正常組平均A450值）/（模型組平均A450值-正常組平均A450值）×100%。

表 1 OARSI評分標準

1.4 統計學方法 采用Prism7軟件。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較均采用q檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人參總皂苷對大鼠足部壓痛閾值的影響 造模4周后模型組與正常組比較壓痛閾值下降，差異有統計學意義（P<0.01），表明碘乙酸造模成功；TSPG-L組、TSPG-M組、TSPG-H組與模型組比較，壓痛閾值均升高，差異有統計學意義（P<0.01），且改善情況與TSPG濃度呈正相關，但仍低于正常組，見圖1。

2.2 人參總皂苷對大鼠足部熱痛閾值的影響 造模4周后模型組與正常組相比較熱痛閾值顯著下降，差異有統計學意義（P<0.01）；TSPG-L、TSPG-M、TSPG-H三組與模型組相比較，痛閾值均顯著升高，且差異有統計學意義（P<0.01），見圖2。

2.3 大鼠膝關節組織學病理切片結果 模型組大鼠膝關節軟骨表面明顯缺損，軟骨基質降解、軟骨細胞丟失，為典型OA退變表現。TSPG組軟骨相較于模型組均有恢復，軟骨表面相對較完整，完整度為TSPG-H>TSPGM>TSPG-L，軟骨細胞和軟骨基質接近正常水平，有肥大軟骨細胞少量，見圖3。與正常組比較，模型組OARSI評分明顯增高（P<0.01），TSPG治療組OARSI評分與模型組比較明顯降低（P<0.01），見圖4。

圖1 人參總皂苷水溶液對大鼠足部壓痛的影響

圖2 人參總皂苷水溶液對大鼠足部熱痛影響

圖3 各組大鼠軟骨組織病理切片（HE染色×100）

2.4 軟骨細胞CCK實驗結果 軟骨細胞培養48 h后，與對照組比較，TSPG組軟骨細胞活力均增高（P<0.05），濃度為200 μg/ml組的軟骨細胞活力最高。見圖5。

圖5 人參總皂苷水溶液對大鼠軟骨細胞活力的影響

3 討論

OA是指以軟骨丟失及伴有關節周圍骨反應為特點的一種滑膜關節病，其中以膝骨關節炎最常見。由多因素共同作用產生，如創傷、病原感染、肥胖、遺傳、年齡、飲食和炎癥等［7］。

多種炎癥因子與OA的發生有密切關系，影響軟骨損失的進展并引起關節疼痛、腫脹、僵硬等臨床表現［8］。在這些炎癥介質中，白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和趨化因子對OA較為重要。IL-1β可通過誘導軟骨細胞凋亡［9-11］、降低Ⅱ型膠原和軟骨細胞中聚集蛋白聚糖的表達［12］等方式損傷軟骨。此外，IL-1β和TNF-α還可通過刺激其他多種炎癥因子的產生，誘導一氧化氮（NO）和活性氧（ROS）的生成，促進OA進展。

人參皂苷已被證實對神經系統、肝臟、腎臟、氣道、腸道等多種器官組織具有抗炎作用［13-17］。多項研究顯示，人參皂苷可抑制IL-1β和TNF-α，減緩關節炎的進展或嚴重程度［18-19］。TSPG可通過抑制促炎因子，上調保護性細胞因子，從而抑制骨關節破壞，緩解疼痛癥狀。TSPG還具有抑制細胞凋亡，改善骨質破壞和促進細胞增殖的作用。體外實驗表明，人參總皂苷可抑制滑膜成纖維細胞分泌基質金屬蛋白酶（MMP）［20］。此外，研究顯示人參皂甙Rg1，Rb2，Rg5等均可抑制OA大鼠關節軟骨細胞凋亡和基質損傷，從而預防關節軟骨的破壞［21-23］。

本實驗結果顯示，模型組與正常組比較，壓痛值和熱痛值降低（P<0.01），關節面破損嚴重，軟骨基質降解、軟骨細胞丟失，提示碘乙酸造模效果良好。TSPG-L組、TSPG-M組、TSPG-H組以關節腔內注射連續治療4周后，各治療組壓痛值均高于模型組，且與劑量呈正相關，提示TSPG能緩解OA大鼠炎性疼痛，提高足部痛閾值。各治療組熱痛閾值相較模型組上升，與各治療組劑量無明顯相關性。軟骨細胞CCK實驗顯示，人參皂苷組細胞增值率提高，且與濃度有關。組織學病理切片顯示，治療組ORASI評分均降低，提示TSPG可以明顯修復受損的軟骨面、軟骨細胞及軟骨細胞外基質。

綜上所述，TSPG對改善關節疼痛、修復受損軟骨療效顯著，其機制可能與抑制炎癥因子，減少軟骨細胞凋亡和基質損傷，促進軟骨細胞修復有關。