基于雄激素受體構建三陰性乳腺癌預后模型

陸翔 陳彩萍 鄔萬新 郭志琴 韓超 薛麗

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）均為陰性的乳腺癌［1］，其發病率占乳腺癌的15%～20%，通常好發于年輕女性，具有侵襲性強、容易轉移、預后較差等特點［2-3］。TNBC屬于異質性疾病，根據基因表達譜可分為多種不同的亞型。TNM分期系統依據腫瘤大小、區域淋巴結受累狀態和有無遠處轉移來預測腫瘤的預后，但由于異質性的存在使TNM分期系統難以預測TNBC的預后。因此，有必要尋找新的生物標志物來輔助TNM分期系統進行更精準的預測。雄激素受體（androgen receptor，AR）廣泛分布于多種器官和組織，不僅參與生殖過程，而且參與惡性腫瘤的發病過程。既往文獻報道AR在TNBC中存在表達，并抑制TNBC的增殖［4］。作者的研究也發現AR在TNBC中的過表達會引起miRNA let-7的升高，使細胞受阻于G1期，抑制細胞增殖，AR和let-7的高表達可能與較好的預后有關［5］。通過檢測分析TNBC患者腫瘤標本的AR表達情況，利用AR和TNM分期構建一個關于TNBC患者術后無病生存率（disease-free survival，DFS）的預測模型。

1 材料和方法

1.1 研究對象 連續性納入2009年1月至2018年7月在本院住院治療的TNBC患者。納入標準：（1）女性；（2）原發性浸潤性乳腺癌；（3）AJCC第8版TNM解剖學分期1～3期；（4）免疫組化檢測ER和PR<1%，免疫組化檢測HER-2為陰性或1+、或FISH檢測HER-2為未擴增［6］；（5）患者依據當時的診療指南接受了規范的治療（包括根治性手術、放療、化療等）；（6）組織庫中有足夠的腫瘤組織供本次檢測。排除標準：（1）<18歲；（2）合并其他惡性腫瘤史；（3）術前接受新輔助化療；（4）未接受規范化治療；（5）術后隨訪≤1次且術后隨訪期<6個月。本研究經醫院倫理委員會的批準，并獲得了患者和家屬的知情同意。

1.2 隨訪方式 隨訪方式包括電話聯系和門診檢查，每年隨訪≥1次。隨訪截止時間為2019年12月31日。主要觀察項目為DFS，次要觀察項目為總生存率（overall survival，OS）。DFS的定義是指從手術日到發生第一次腫瘤事件、死亡、無事件患者的最后一次隨訪日，第一次腫瘤事件是指出現局部/區域性乳腺癌復發、乳腺癌遠處轉移、對側乳腺浸潤性癌或原位癌、其他原發性浸潤性癌。OS被定義為從手術日到任何原因引起的死亡或存活患者的最后一次隨訪日。

1.3 AR檢測及判定方法 采用免疫組化EnVision兩步法檢測福爾馬林固定石蠟包埋的乳腺癌標本的AR表達。石蠟切片，脫蠟、水化。切片入Tris-EDTA緩沖液（pH 9.0）中進行抗原修復20 min（水浴，96℃～98℃）。冷卻至室溫，流水沖洗。切片滴加兔抗人AR單克隆抗體（克隆號：EP120；公司：北京中杉金橋生物技術有限公司；稀釋度：1∶200），室溫孵育2 h。采用二抗檢測試劑盒（Dako REAL EnVisionTM Detection System）和DAB顯色。蘇木素復染，藍化，梯度酒精脫水，二甲苯透明和封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。AR定位于細胞核，當細胞核中出現棕黃色顆粒時判定為AR陽性細胞。隨機選取高倍鏡下5個不重疊的視野，對陽性細胞的染色強弱和陽性細胞占比打分。染色強度評分標準：不染色0分，輕度染色1分，中度染色2分，強染色3分。陽性細胞占比評分標準：無細胞染色0分，≤25%細胞染色1分，26%～49%細胞染色2分，≥50%細胞染色3分。上述檢測由兩位經驗豐富的病理科醫生獨立完成，對于不同結果由兩位醫生共同再次閱片并討論后給出一致結果。以染色強度、陽性細胞占比兩者得分的乘積（簡稱：AR乘積）作為AR的最終結果，即AR乘積=AR染色強度評分×AR陽性細胞占比評分。

1.4 統計學方法 采用SPSS （22.0版）和R（3.5.1版）軟件處理數據。計數資料采用Pearson卡方檢驗。相關性分析采用Spearman檢驗法。生存分析采用Kaplan-Meier方法，Log-rank檢驗組間生存曲線差異。多因素生存分析采用COX回歸分析，選擇方法為“向后：LR”。根據COX回歸分析結果構建預后指數（PI），公式為PI=風險系數1×變量1+風險系數2×變量2+……+風險系數n×變量n。公式中的變量是指DFS的獨立預后因素，風險系數是該獨立預后因素的風險系數。基于COX回歸分析結果建立列線圖，并用C指數和驗證曲線驗證列線圖的可靠性。所有統計檢驗均為雙側檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者的一般資料和隨訪情況 共納入176例患者，年齡28～88歲，中位年齡53.0歲。絕經前患者90例，絕經后患者86例。病理學類型：浸潤性乳腺癌非特殊類型160例，浸潤性小葉癌1例，伴大汗腺分化的浸潤性癌8例，伴髓樣特征的浸潤性癌4例，伴鱗狀細胞癌化生的浸潤性癌2例，腺樣囊性癌1例。腫瘤最大徑0.2～8.5 cm，中位2.2 cm。腋窩淋巴結陰性112例，腋窩淋巴結陽性64例。腋窩淋巴結陽性患者的陽性淋巴結數為1～35枚，中位3枚。組織學分級：1級0例，2級47例，3級129例。Ki-67≤30%為58例，Ki-67>30%為118例。根據AJCC第八版TNM分期，解剖學分期1～3期分別為62例、86例和28例。隨訪期260～3754 d，中位1285.5 d。隨訪期內有21例患者出現乳腺癌復發轉移（包括肺骨同時轉移3例、肺轉移6例、肝轉移5例、骨轉移、腦轉移和區域淋巴結轉移各2例、局部復發1例），有2例患者出現對側原發性浸潤性乳腺癌，有8例患者出現其他原發性惡性腫瘤（包括肺癌3例、卵巢癌2例、結腸癌1例、甲狀腺癌1例、腎癌1例）。死亡13例，其中死于乳腺癌11例，死于卵巢癌2例。

2.2 AR免疫組化檢測結果 AR染色強度：0分103例、1分25例、2分27例、3分21例（見圖1）。AR陽性細胞比例：0分103例、1分23例、2分18例、3分32例。兩者正相關（相關系數=0.978，P<0.001）。AR乘積：0分103例、1分15例、2分17例、3分1例、4分9例、6分10例、9分21例。以2分為閾值將患者分為AR陽性組（AR乘積≥2）和AR陰性組（AR乘積<2），AR陽性率為33.0%（58/176）。兩組間比較：AR陽性組>50歲者占比較大、浸潤性乳腺癌非特殊類型的占比較小、組織學分級為2級的占比較大、Ki-67≤30%的占比較大、TNM解剖學分期相對較早（見表1）。

圖1 AR不同染色強度評分病理圖（×200）。A．不染色0分；B．輕度染色1分；C．中度染色2分；D．強染色3分

表1 AR與臨床病理特征間的關系

2.3 生存分析結果 單因素生存分析提示AR乘積、腋窩淋巴結和TNM解剖學分期是DFS的影響因素（見圖2）。多因素生存分析提示AR乘積和TNM解剖學分期是DFS的獨立影響因素。

2.4 構 建PI預 后 模 型 建 立PI公 式：PI=-0.535×AR乘積 + BTNM。其中當TNM為1期時，BTNM=-1.937，當TNM為2期時，BTNM=-1.562，當TNM為3期時，BTNM=0。計算每個患者的PI指數。通過測算按以下標準將患者分成三組：PI<-3為低風險組，共45例；-3≤PI<0為中風險組，共114例；PI≥0為高風險組，共17例。三組間DFS、OS差異均有統計學意義，低風險組的復發、死亡風險最低，高風險組的復發、死亡風險最高（見圖2D、E），提示該分組方法能夠準確預測患者的復發、死亡風險。根據PI公式繪制列線圖用于預測TNBC患者術后3年、5年的DFS風險，內部驗證法提示該列線圖的C指數為0.719，校準曲線提示預測值和實際結果之間基本重合，提示該列線圖有較好的預測能力（見圖3）。

圖2 176例TNBC患者生存曲線圖。A． 腋窩淋巴結（P=0．007）；B． TNM解剖學分期（P<0．001）；C． AR乘積（P=0．041）；D． PI風險模型（P<0．001）；E． PI 風險模型（P<0．001）

圖3 列線圖及校準曲線。A． 列線圖（根據患者的TNM解剖學分期和AR乘積分別在第二、三橫軸找到相應位置，向上作垂線與第一橫軸相交，獲得相應的分值，將兩分值相加的總分標記于第4橫軸相應位置，并向下畫垂線與第5、6橫軸相交，獲得3年、5年DFS風險）；B． 3年DFS風險的校準曲線（橫坐標代表由列線圖預測的3年DFS風險，縱坐標代表實際觀測到的3年DFS風險，紅線與對角線幾乎重合，說明該列線圖對3年DFS風險具有很好的預測能力）；C． 5年DFS風險的校準曲線（橫坐標代表由列線圖預測的5年DFS風險，縱坐標代表實際觀測到的5年DFS風險，紅線與對角線幾乎重合，說明該列線圖對5年DFS風險具有較好的預測能力）

3 討論

TNBC屬于異質性疾病，其預后與患者年齡、腫瘤直徑、組織學分級、血管有無侵犯、P53狀態和Ki-67水平無關［4］，在本研究中也觀察到類似的結果。文獻報道某些基因的表達狀態有助于預測TNBC的預后［7］，但基因檢測無論是技術還是費用對于當前我國臨床實際而言均難以推廣。因此，有必要尋找新的、廉價的、易檢測的生物標志物來幫助判斷TNBC的預后。根據圖2B，TNM 1期和2期患者的DFS曲線有交叉，而基于AR構建的PI預后模型三組之間DFS曲線無交叉（見圖2D），提示AR可能是合適的生物標志物。

AR與TNBC預后之間的關系存在爭議，有研究認為AR陽性提示TNBC的預后較好［8］，也有研究持相反觀點［9］。存在爭議的原因除種族差異外［10］，也與不同研究對AR閾值定義的不同有關，如有的研究將AR陽性定義為AR陽性細胞比例≥10%，有些研究將其定義為1%，也有研究將免疫組化檢測存在核染色定義為AR陽性，也有通過計算AR陽性細胞占比和AR染色強度積分來定義AR水平。不同的定義可能導致不同的研究結果。本研究采用最后一種方法，其優點是同時考慮了陽性細胞的染色強弱和陽性細胞的占比，兩者相乘后可得到7個不同的評分，可以更精細地區分患者，避免不合理的閾值定義造成結果偏差。根據列線圖可知AR乘積與DFS負相關，AR乘積越大，AR蛋白表達水平越高，DFS風險越低。在表1中，為了便于描述AR表達水平與臨床病理特征間的關系，本研究將AR乘積≥2定義為陽性，AR陽性率為33.0%（58/176）。

通過對AR的檢測分析構建了一個新的預測TNBC患者術后DFS風險的模型，目的是在不顯著增加患者醫療費用的情況下，更準確地評估DFS風險。其作用包括兩方面：對于高危患者，鼓勵患者按指南進行規范化、足療程的輔助治療十分重要，不要輕易放棄治療，以達到更好的治療效果；對于低危患者，告知患者低危復發風險有助于減輕患者的心理壓力，可以更好地面對病情，增強戰勝疾病的信心，提高生活質量。由于缺少循證醫學證據，不建議根據該預測結果增減輔助治療。

AR與TNBC預后相關性的機制尚未完全闡明，可能與AR上調let-7a，進一步下調CMYC和KRAS，使細胞增殖抑制有關。今后通過對其機制的進一步研究，將有可能找到一些新的生物標志物，有助于構建更完善的預后模型。

本研究作為一個單中心回顧性研究，存在樣本量偏小等缺陷，可能導致結果偏差。今后可通過多中心合作、增加患者數量，使該模型的預測結果更加準確。