基于雄激素受體構(gòu)建三陰性乳腺癌預(yù)后模型

陸翔 陳彩萍 鄔萬新 郭志琴 韓超 薛麗

三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）均為陰性的乳腺癌［1］，其發(fā)病率占乳腺癌的15%～20%，通常好發(fā)于年輕女性，具有侵襲性強(qiáng)、容易轉(zhuǎn)移、預(yù)后較差等特點(diǎn)［2-3］。TNBC屬于異質(zhì)性疾病，根據(jù)基因表達(dá)譜可分為多種不同的亞型。TNM分期系統(tǒng)依據(jù)腫瘤大小、區(qū)域淋巴結(jié)受累狀態(tài)和有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移來預(yù)測腫瘤的預(yù)后，但由于異質(zhì)性的存在使TNM分期系統(tǒng)難以預(yù)測TNBC的預(yù)后。因此，有必要尋找新的生物標(biāo)志物來輔助TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行更精準(zhǔn)的預(yù)測。雄激素受體（androgen receptor，AR）廣泛分布于多種器官和組織，不僅參與生殖過程，而且參與惡性腫瘤的發(fā)病過程。既往文獻(xiàn)報道AR在TNBC中存在表達(dá)，并抑制TNBC的增殖［4］。作者的研究也發(fā)現(xiàn)AR在TNBC中的過表達(dá)會引起miRNA let-7的升高，使細(xì)胞受阻于G1期，抑制細(xì)胞增殖，AR和let-7的高表達(dá)可能與較好的預(yù)后有關(guān)［5］。通過檢測分析TNBC患者腫瘤標(biāo)本的AR表達(dá)情況，利用AR和TNM分期構(gòu)建一個關(guān)于TNBC患者術(shù)后無病生存率（disease-free survival，DFS）的預(yù)測模型。

1 材料和方法

1.1 研究對象 連續(xù)性納入2009年1月至2018年7月在本院住院治療的TNBC患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）女性；（2）原發(fā)性浸潤性乳腺癌；（3）AJCC第8版TNM解剖學(xué)分期1～3期；（4）免疫組化檢測ER和PR<1%，免疫組化檢測HER-2為陰性或1+、或FISH檢測HER-2為未擴(kuò)增［6］；（5）患者依據(jù)當(dāng)時的診療指南接受了規(guī)范的治療（包括根治性手術(shù)、放療、化療等）；（6）組織庫中有足夠的腫瘤組織供本次檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）<18歲；（2）合并其他惡性腫瘤史；（3）術(shù)前接受新輔助化療；（4）未接受規(guī)范化治療；（5）術(shù)后隨訪≤1次且術(shù)后隨訪期<6個月。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，并獲得了患者和家屬的知情同意。

1.2 隨訪方式 隨訪方式包括電話聯(lián)系和門診檢查，每年隨訪≥1次。隨訪截止時間為2019年12月31日。主要觀察項(xiàng)目為DFS，次要觀察項(xiàng)目為總生存率（overall survival，OS）。DFS的定義是指從手術(shù)日到發(fā)生第一次腫瘤事件、死亡、無事件患者的最后一次隨訪日，第一次腫瘤事件是指出現(xiàn)局部/區(qū)域性乳腺癌復(fù)發(fā)、乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、對側(cè)乳腺浸潤性癌或原位癌、其他原發(fā)性浸潤性癌。OS被定義為從手術(shù)日到任何原因引起的死亡或存活患者的最后一次隨訪日。

1.3 AR檢測及判定方法 采用免疫組化EnVision兩步法檢測福爾馬林固定石蠟包埋的乳腺癌標(biāo)本的AR表達(dá)。石蠟切片，脫蠟、水化。切片入Tris-EDTA緩沖液（pH 9.0）中進(jìn)行抗原修復(fù)20 min（水浴，96℃～98℃）。冷卻至室溫，流水沖洗。切片滴加兔抗人AR單克隆抗體（克隆號：EP120；公司：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；稀釋度：1∶200），室溫孵育2 h。采用二抗檢測試劑盒（Dako REAL EnVisionTM Detection System）和DAB顯色。蘇木素復(fù)染，藍(lán)化，梯度酒精脫水，二甲苯透明和封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。AR定位于細(xì)胞核，當(dāng)細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒時判定為AR陽性細(xì)胞。隨機(jī)選取高倍鏡下5個不重疊的視野，對陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)弱和陽性細(xì)胞占比打分。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：不染色0分，輕度染色1分，中度染色2分，強(qiáng)染色3分。陽性細(xì)胞占比評分標(biāo)準(zhǔn)：無細(xì)胞染色0分，≤25%細(xì)胞染色1分，26%～49%細(xì)胞染色2分，≥50%細(xì)胞染色3分。上述檢測由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生獨(dú)立完成，對于不同結(jié)果由兩位醫(yī)生共同再次閱片并討論后給出一致結(jié)果。以染色強(qiáng)度、陽性細(xì)胞占比兩者得分的乘積（簡稱：AR乘積）作為AR的最終結(jié)果，即AR乘積=AR染色強(qiáng)度評分×AR陽性細(xì)胞占比評分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS （22.0版）和R（3.5.1版）軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料采用Pearson卡方檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)法。生存分析采用Kaplan-Meier方法，Log-rank檢驗(yàn)組間生存曲線差異。多因素生存分析采用COX回歸分析，選擇方法為“向后：LR”。根據(jù)COX回歸分析結(jié)果構(gòu)建預(yù)后指數(shù)（PI），公式為PI=風(fēng)險系數(shù)1×變量1+風(fēng)險系數(shù)2×變量2+……+風(fēng)險系數(shù)n×變量n。公式中的變量是指DFS的獨(dú)立預(yù)后因素，風(fēng)險系數(shù)是該獨(dú)立預(yù)后因素的風(fēng)險系數(shù)。基于COX回歸分析結(jié)果建立列線圖，并用C指數(shù)和驗(yàn)證曲線驗(yàn)證列線圖的可靠性。所有統(tǒng)計檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的一般資料和隨訪情況 共納入176例患者，年齡28～88歲，中位年齡53.0歲。絕經(jīng)前患者90例，絕經(jīng)后患者86例。病理學(xué)類型：浸潤性乳腺癌非特殊類型160例，浸潤性小葉癌1例，伴大汗腺分化的浸潤性癌8例，伴髓樣特征的浸潤性癌4例，伴鱗狀細(xì)胞癌化生的浸潤性癌2例，腺樣囊性癌1例。腫瘤最大徑0.2～8.5 cm，中位2.2 cm。腋窩淋巴結(jié)陰性112例，腋窩淋巴結(jié)陽性64例。腋窩淋巴結(jié)陽性患者的陽性淋巴結(jié)數(shù)為1～35枚，中位3枚。組織學(xué)分級：1級0例，2級47例，3級129例。Ki-67≤30%為58例，Ki-67>30%為118例。根據(jù)AJCC第八版TNM分期，解剖學(xué)分期1～3期分別為62例、86例和28例。隨訪期260～3754 d，中位1285.5 d。隨訪期內(nèi)有21例患者出現(xiàn)乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移（包括肺骨同時轉(zhuǎn)移3例、肺轉(zhuǎn)移6例、肝轉(zhuǎn)移5例、骨轉(zhuǎn)移、腦轉(zhuǎn)移和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各2例、局部復(fù)發(fā)1例），有2例患者出現(xiàn)對側(cè)原發(fā)性浸潤性乳腺癌，有8例患者出現(xiàn)其他原發(fā)性惡性腫瘤（包括肺癌3例、卵巢癌2例、結(jié)腸癌1例、甲狀腺癌1例、腎癌1例）。死亡13例，其中死于乳腺癌11例，死于卵巢癌2例。

2.2 AR免疫組化檢測結(jié)果 AR染色強(qiáng)度：0分103例、1分25例、2分27例、3分21例（見圖1）。AR陽性細(xì)胞比例：0分103例、1分23例、2分18例、3分32例。兩者正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)=0.978，P<0.001）。AR乘積：0分103例、1分15例、2分17例、3分1例、4分9例、6分10例、9分21例。以2分為閾值將患者分為AR陽性組（AR乘積≥2）和AR陰性組（AR乘積<2），AR陽性率為33.0%（58/176）。兩組間比較：AR陽性組>50歲者占比較大、浸潤性乳腺癌非特殊類型的占比較小、組織學(xué)分級為2級的占比較大、Ki-67≤30%的占比較大、TNM解剖學(xué)分期相對較早（見表1）。

圖1 AR不同染色強(qiáng)度評分病理圖（×200）。A．不染色0分；B．輕度染色1分；C．中度染色2分；D．強(qiáng)染色3分

表1 AR與臨床病理特征間的關(guān)系

2.3 生存分析結(jié)果 單因素生存分析提示AR乘積、腋窩淋巴結(jié)和TNM解剖學(xué)分期是DFS的影響因素（見圖2）。多因素生存分析提示AR乘積和TNM解剖學(xué)分期是DFS的獨(dú)立影響因素。

2.4 構(gòu) 建PI預(yù) 后 模 型 建 立PI公 式：PI=-0.535×AR乘積 + BTNM。其中當(dāng)TNM為1期時，BTNM=-1.937，當(dāng)TNM為2期時，BTNM=-1.562，當(dāng)TNM為3期時，BTNM=0。計算每個患者的PI指數(shù)。通過測算按以下標(biāo)準(zhǔn)將患者分成三組：PI<-3為低風(fēng)險組，共45例；-3≤PI<0為中風(fēng)險組，共114例；PI≥0為高風(fēng)險組，共17例。三組間DFS、OS差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，低風(fēng)險組的復(fù)發(fā)、死亡風(fēng)險最低，高風(fēng)險組的復(fù)發(fā)、死亡風(fēng)險最高（見圖2D、E），提示該分組方法能夠準(zhǔn)確預(yù)測患者的復(fù)發(fā)、死亡風(fēng)險。根據(jù)PI公式繪制列線圖用于預(yù)測TNBC患者術(shù)后3年、5年的DFS風(fēng)險，內(nèi)部驗(yàn)證法提示該列線圖的C指數(shù)為0.719，校準(zhǔn)曲線提示預(yù)測值和實(shí)際結(jié)果之間基本重合，提示該列線圖有較好的預(yù)測能力（見圖3）。

圖2 176例TNBC患者生存曲線圖。A． 腋窩淋巴結(jié)（P=0．007）；B． TNM解剖學(xué)分期（P<0．001）；C． AR乘積（P=0．041）；D． PI風(fēng)險模型（P<0．001）；E． PI 風(fēng)險模型（P<0．001）

圖3 列線圖及校準(zhǔn)曲線。A． 列線圖（根據(jù)患者的TNM解剖學(xué)分期和AR乘積分別在第二、三橫軸找到相應(yīng)位置，向上作垂線與第一橫軸相交，獲得相應(yīng)的分值，將兩分值相加的總分標(biāo)記于第4橫軸相應(yīng)位置，并向下畫垂線與第5、6橫軸相交，獲得3年、5年DFS風(fēng)險）；B． 3年DFS風(fēng)險的校準(zhǔn)曲線（橫坐標(biāo)代表由列線圖預(yù)測的3年DFS風(fēng)險，縱坐標(biāo)代表實(shí)際觀測到的3年DFS風(fēng)險，紅線與對角線幾乎重合，說明該列線圖對3年DFS風(fēng)險具有很好的預(yù)測能力）；C． 5年DFS風(fēng)險的校準(zhǔn)曲線（橫坐標(biāo)代表由列線圖預(yù)測的5年DFS風(fēng)險，縱坐標(biāo)代表實(shí)際觀測到的5年DFS風(fēng)險，紅線與對角線幾乎重合，說明該列線圖對5年DFS風(fēng)險具有較好的預(yù)測能力）

3 討論

TNBC屬于異質(zhì)性疾病，其預(yù)后與患者年齡、腫瘤直徑、組織學(xué)分級、血管有無侵犯、P53狀態(tài)和Ki-67水平無關(guān)［4］，在本研究中也觀察到類似的結(jié)果。文獻(xiàn)報道某些基因的表達(dá)狀態(tài)有助于預(yù)測TNBC的預(yù)后［7］，但基因檢測無論是技術(shù)還是費(fèi)用對于當(dāng)前我國臨床實(shí)際而言均難以推廣。因此，有必要尋找新的、廉價的、易檢測的生物標(biāo)志物來幫助判斷TNBC的預(yù)后。根據(jù)圖2B，TNM 1期和2期患者的DFS曲線有交叉，而基于AR構(gòu)建的PI預(yù)后模型三組之間DFS曲線無交叉（見圖2D），提示AR可能是合適的生物標(biāo)志物。

AR與TNBC預(yù)后之間的關(guān)系存在爭議，有研究認(rèn)為AR陽性提示TNBC的預(yù)后較好［8］，也有研究持相反觀點(diǎn)［9］。存在爭議的原因除種族差異外［10］，也與不同研究對AR閾值定義的不同有關(guān)，如有的研究將AR陽性定義為AR陽性細(xì)胞比例≥10%，有些研究將其定義為1%，也有研究將免疫組化檢測存在核染色定義為AR陽性，也有通過計算AR陽性細(xì)胞占比和AR染色強(qiáng)度積分來定義AR水平。不同的定義可能導(dǎo)致不同的研究結(jié)果。本研究采用最后一種方法，其優(yōu)點(diǎn)是同時考慮了陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)弱和陽性細(xì)胞的占比，兩者相乘后可得到7個不同的評分，可以更精細(xì)地區(qū)分患者，避免不合理的閾值定義造成結(jié)果偏差。根據(jù)列線圖可知AR乘積與DFS負(fù)相關(guān)，AR乘積越大，AR蛋白表達(dá)水平越高，DFS風(fēng)險越低。在表1中，為了便于描述AR表達(dá)水平與臨床病理特征間的關(guān)系，本研究將AR乘積≥2定義為陽性，AR陽性率為33.0%（58/176）。

通過對AR的檢測分析構(gòu)建了一個新的預(yù)測TNBC患者術(shù)后DFS風(fēng)險的模型，目的是在不顯著增加患者醫(yī)療費(fèi)用的情況下，更準(zhǔn)確地評估DFS風(fēng)險。其作用包括兩方面：對于高危患者，鼓勵患者按指南進(jìn)行規(guī)范化、足療程的輔助治療十分重要，不要輕易放棄治療，以達(dá)到更好的治療效果；對于低危患者，告知患者低危復(fù)發(fā)風(fēng)險有助于減輕患者的心理壓力，可以更好地面對病情，增強(qiáng)戰(zhàn)勝疾病的信心，提高生活質(zhì)量。由于缺少循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，不建議根據(jù)該預(yù)測結(jié)果增減輔助治療。

AR與TNBC預(yù)后相關(guān)性的機(jī)制尚未完全闡明，可能與AR上調(diào)let-7a，進(jìn)一步下調(diào)CMYC和KRAS，使細(xì)胞增殖抑制有關(guān)。今后通過對其機(jī)制的進(jìn)一步研究，將有可能找到一些新的生物標(biāo)志物，有助于構(gòu)建更完善的預(yù)后模型。

本研究作為一個單中心回顧性研究，存在樣本量偏小等缺陷，可能導(dǎo)致結(jié)果偏差。今后可通過多中心合作、增加患者數(shù)量，使該模型的預(yù)測結(jié)果更加準(zhǔn)確。