CPNE1蛋白在肺腺癌組織中的表達及臨床意義

許正卿 周敏 宋鵬濤 王金志 劉順林*

肺癌是導致癌癥死亡的主要惡性疾病。非小細胞肺癌是肺癌的主要病理類型，腺癌占比最高［1-2］。由于肺癌的發(fā)病率和病死率較高，早診斷早治療，對患者預后起重要作用。作為Copines家族中第一個被發(fā)現(xiàn)的成員，CPNE1在骨肉瘤中具有重要的臨床意義［3］，但目前尚未發(fā)現(xiàn)其在肺癌中的作用。本實驗采用免疫組化方法檢測CPNE1蛋白在肺腺癌組織與肺正常組織中的表達情況，并結(jié)合臨床資料進行分析，初步探討CPNE1在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 肺腺癌石蠟組織標本收集 收集于浙江省湖州市中心醫(yī)院、浙江省安吉縣人民醫(yī)院2006年至2009年外科切除且經(jīng)病理確診的人肺腺癌石蠟包埋標本128例，所有患者術前均未進行放、化療。樣本中男67例，女61例，年齡22～80歲，平均年齡61歲。正常肺組織30例，男20例，女10例；年齡46～74歲，平均年齡60歲。所有組織標本均經(jīng)兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生證實。所有標本均按照2009年國際抗癌聯(lián)盟（AJCC，2009）TNM分期標準進行臨床分期，Ⅰ、Ⅱ期69例，Ⅲ、Ⅳ期59例；按分化程度低分化65例，高、中分化63例。

1.2 試劑與方法 實驗所用組織蠟塊經(jīng)連續(xù)切片成4 μm厚度后進行免疫組化染色，免疫組化試劑盒及兔抗人CPNE1多克隆抗體購自Santa Cruz公司（美國）。采用免疫組化方法檢測CPNE1蛋白在肺癌組織中的表達，抗體稀釋液代替作為陰性對照。

1.3 免疫組化結(jié)果判定 CPNE1蛋白在肺腺癌組織及肺正常組織中免疫組化結(jié)果判斷標準參考YU等［4］報道方法。CPNE1蛋白陽性表達為在細胞質(zhì)及細胞膜上呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。在高倍鏡下（SP×400）觀察下，以5個不同視野為隨機采取對象，計算陽性細胞總數(shù)，按照陽性細胞數(shù)所占百分比計算分值：1分為陽性細胞所占百分比<10%，2分為陽性細胞所占百分比>10%且≤50%，3分為陽性細胞所占百分比>50%且≤75%，4分為陽性細胞所占百分比>75%；同時，按照染色強弱不同程度計算分值：1分陰性，2分弱染色，3分中等強度染色，4分強染色。通過上述兩種不同計算分值乘積判斷結(jié)果：<4分為（-）；4～8分為（+）；>8～12分為（++）；>12～16分為（+++）。高表達為（++）和（+++）級；低表達為（-）和（+）級。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CPNE1在肺腺癌組織與肺正常組織中表達 CPNE1蛋白表達主要定位在細胞質(zhì)中，在細胞膜表達較少，見圖1。低表達49例（38.28%），高表達79例（61.72%），30例肺正常組織均為低表達。

2.2 CPNE1表達高低與患者臨床病理參數(shù)的相關性 CPNE1蛋白的表達與肺腺癌組織臨床分期（P<0.05）、TNM分期（P<0.05）、遠處轉(zhuǎn)移（P<0.05）存在相關性，見表1。

圖1 CPNE1在肺腺癌組織與肺正常組織中表達

表1 CPNE1表達與臨床病理資料的相關性［n（%）］

3 討論

據(jù)最新的全球腫瘤發(fā)病統(tǒng)計資料顯示，肺癌的發(fā)病率和死亡率居各種惡性腫瘤的首位，而且對其能做出早期診斷和預后判斷的有效分子標志物極少。根據(jù)目前的研究，多種癌基因和抑癌基因突變在肺癌的發(fā)生發(fā)展中起相當作用，如癌基因K-RAS、EGFR、PD-L1，抑癌基因突變TP53、RB等［5-6］。近年來，研究認為肺癌是一種具有異質(zhì)性的疾病，不同癌基因、抑癌基因參與不同患者的發(fā)病，即便是同一個患者肺癌的發(fā)病過程中，也可能存在不同的癌基因或抑癌基因參與［7-9］。目前所知的癌基因、抑癌基因突變并不能解釋所有的肺癌發(fā)生發(fā)展，這也提示存在不為所知的基因參與到肺癌的發(fā)病中。

CPNE蛋白家族（Copines）是一類磷脂結(jié)合蛋白，家族成員均有共同的結(jié)構特征：C末端有1個A結(jié)構域，與整和蛋白胞外區(qū)段的A結(jié)構域間具有較高的同源性；N末端有2個C2結(jié)構域，與具有Ca2+依賴和磷脂結(jié)合特性的C2結(jié)構域具有高度相似性。整和蛋白的A結(jié)構域能與Ca2+和Mg2+結(jié)合，也是整和蛋白與胞外配體發(fā)生蛋白相互作用的結(jié)構域。CPNE蛋白與其目標蛋白相互作用可能與目標蛋白募集或調(diào)節(jié)目標蛋白的酶活性有關［10-11］。

CPNE1作為一種可溶性膜結(jié)合蛋白，可以通過C末端A結(jié)構域與不同細胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合。進一步研究表明，該A結(jié)構域已在多種整合素和細胞外基質(zhì)蛋白中進行研究，并可作為蛋白結(jié)合域［12］。C2結(jié)構域?qū)︹}和磷脂結(jié)合非常重要［13-14］。此外，多種蛋白質(zhì)已被鑒定為Copine靶標，其中較多是參與細胞內(nèi)信號通路的蛋白質(zhì)，包括MEK1/ERK、蛋白磷酸酶5和CDC42調(diào)節(jié)蛋白激酶［15］。最近一項研究表明，在前列腺癌中CPNE 1表達高于正常前列腺組織，CPNE1過表達與前列腺癌患者分期及預后相關，且CPNE 1可以作為前列腺癌診斷的一個指標，進一步通過TCGA數(shù)據(jù)共表達分析發(fā)現(xiàn)CPNE1與TRAF2顯著相關［16-17］。而在骨肉瘤中的研究顯示，干擾CPNE 1可以抑制骨肉瘤Saos-2細胞的增殖和克隆，并對細胞凋亡有促進作用。干擾骨肉瘤中CPNE 1的表達使Saos-2細胞可以改變基因表達譜。改變的基因參與多種信號傳導途徑，包括MAPK途徑，TGF-β通道等。此外，高群等［18］研究CPNE 1與細胞凋亡的關系，在體外缺氧/復氧誘導的H9c2細胞中，干擾CPNE 1基因后發(fā)現(xiàn)，干擾CPNE 1基因表達后同時下調(diào)C-caspase3蛋白表達，降低細胞凋亡率。通過敲減心肌細胞CPNE 1基因的表達，可以使凋亡相關Bcl-2蛋白表達上調(diào)、同時Bax蛋白表達出現(xiàn)下調(diào)，該研究結(jié)果表明CPNE 1能夠抑制心肌H9c2細胞凋亡［18-19］。此外 C-caspase 3是Caspase 3的剪切體，也是細胞凋亡發(fā)生的分子標志物，參與多種細胞凋亡過程［20］。干擾CPNE 1基因表達后可能通過NF-κB活性增強抑制心肌細胞的凋亡發(fā)生，從而發(fā)揮心肌保護作用［21-22］。

CPNE 1在非小細胞肺癌中的作用尚不清楚。本資料結(jié)果顯示，CPNE 1在腺癌中的表達高于正常肺組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明CPNE1在肺腺癌中可能起到促癌基因的作用。進一步分析CPNE 1蛋白表達與肺癌患者臨床病理各參數(shù)的相關關系，分層分析發(fā)現(xiàn)CPNE 1基因表達水平與非小細胞肺癌患者性別、年齡、腫瘤大小無明顯相關性（P>0.05），但在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組織中表達高于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），提示CPNE 1基因表達水平可能與非小細胞肺癌患者預后有關。非小細胞肺癌中CPNE 1基因具有促癌作用，但其如何介導肺癌的發(fā)生發(fā)展目前尚未得知，需進一步研究。