CD34在肺腺癌浸潤性病灶診斷中的意義

楊柳 任興昌* 吳麗娟 楊文偉 舒暢 方敏

目前認為大多數肺腺癌是通過肺泡上皮腺瘤樣不典型增生（AAH）發展成為微浸潤腺癌，最終成為浸潤性腺癌，因所處的時間階段不同，其細胞形態與相關組織結構發生多樣性變化，在病理診斷工作中，經常可以觀察到一些組織結構非常復雜的現象與經典的原位腺癌診斷標準存在一定差別，給臨床診斷帶來困惑［1］。除了疾病本身發展的多樣性，還包括手術中、制片過程中組織擠壓等，冰凍切片后肺泡結構塌陷，肺泡內組織細胞增多等情況下，原位腺癌與貼壁型、腺泡型等，浸潤性癌的形態重疊，難以準確辨認，需要借助免疫組化表達鑒別病變的性質和范圍。本文探討CD34在肺腺癌中判斷是否有浸潤性改變的應用價值。

1 資料與方法

1.1 臨床材料 選擇2015年1月至2019年12月本院肺腺癌標本患者100例，確診為原發性非小細胞肺癌（NSCLC），包括穿刺標本9例及亞肺葉切除（肺段切除、楔形切除）91例。其中原位腺癌18例，微浸潤性腺癌23例，貼壁為主型肺腺癌10例。其余均為浸潤性肺腺癌，包含腺泡為主型腺癌21例，乳頭為主型腺癌9例，微乳頭為主型腺癌7例，實體為主型伴黏液產生腺癌12例。所有病理切片均采用蘇木精-伊紅（HE）染色，行免疫組化，包括CD34、CD31、F8、Ki67、P53、TTF-1、NapsinA。并回顧性分析病史，電話隨訪，復閱切片。

1.2 方法 收錄的樣本均使用濃度為10%福爾馬林完成固定，規范取材，常規脫水、透明、經石蠟完成包埋，制成規格為4 μm厚連續切片并行HE染及免疫組化染色。免疫組化采用EnVision 兩步法，深達自動免疫組化儀，選擇CD34、CD31、P53抗體和相關試劑盒為福州邁新公司出品；F8、Ki67、TTF-1、NapsinA為北京中杉公司出品。PH9.0一抗修復抗原，二抗購于廈門通靈生物醫藥公司，采用葡萄串式多聚法生產的二抗檢測試劑，將陽性切片及自身陽性作為陽性對照。使用PBS用于替代一抗視為陰性對照組。

1.3 判定方式 免疫組化切片由2位經驗豐富的病理科醫師閱片審核。CD34以清晰棕黃色顆粒著色在肺泡壁毛細血管內皮細胞胞膜、胞質均勻完整的勾勒出毛細血管網為完整表達，以毛細血管網缺乏連續性、消失為表達缺失；CD31為胞膜陽性，TTF-1、P53、Ki-67為核著色，天冬氨酸蛋白酶Napsin-A、F8陽性部位為胞質。

1.4 觀察指標 免疫組化標記物CD34、CD31、F8、TTF-1、Napsin-A、ki-67、P53在肺腺癌中的表達情況、患者年齡、性別、吸煙史、淋巴結及遠處轉移、脈管癌栓、是否復發、死亡率。

1.5 統計學方法 采用SPSS 25.0統計學軟件。計量資料用t檢驗，計數資料用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 常用血管內皮相關標記物對肺泡壁結構的顯示情況及TTF-1、NapsinA對肺腺癌的免疫組化表達情況CD31、F8均不能勾勒出肺泡壁的結構；CD34于非腫瘤性肺泡及貼壁生長的原位腺癌區均能較好顯示肺泡壁的網狀結構（見圖1）。原位腺癌及貼壁生長的腺癌中，腫瘤上皮細胞伴行肺泡壁結構呈現棕黃色均勻完整的表達肺泡壁毛細血管網結構，連續性好，清晰可見，在有組織細胞充填肺泡腔或肺泡纖維增厚顯著的區域仍能容易判別肺泡壁結構的完整性；而在微浸潤及浸潤性癌中CD34呈現的肺泡壁毛細血管網不同程度表達消失，混亂，缺乏連續性，肺泡壁被腫瘤相關纖維組織增生破壞，血管少而稀疏（見圖2、3）。兩者CD34間質表達情況差異有統計學意義（P<0.01）。腺癌組織TTF-1與NapsinA總體表達率分別為100%和97.5%。

2.2 各類型肺腺癌中CD34、P53、Ki67的表達與臨床病理特征的關系 CD34所標記診斷的早期腺癌及微浸潤性腺癌的平均年齡低于浸潤性腺癌（P<0.05）。腺癌總體性別女性大于男性（63% vs 37%）。浸潤性癌吸煙率高于早期腺癌。淋巴結轉移率、脈管癌栓，復發率和死亡率比較，浸潤性腺癌明顯高于早期腺癌（P<0.05）。見表1。

圖1 A． 原位癌，HE染色（×10．0）。B． CD34標記肺泡壁毛細血管網完整，癌細胞局限在肺泡壁內。C． CD31血管及組織細胞陽性（×10．0）。D． F8（×10．0）

圖2 A． HE染色 原位癌（×3．0）。B． CD34標記完整肺泡結構，證實癌細胞局限在肺泡壁內。C． HE染色 微浸潤性癌（×3．0）。D． CD34在原位癌1區域肺泡結構呈陽性表達，在微浸潤性2區域表達缺失。E． HE染色 浸潤性癌（×3．0）。F． 浸潤性癌CD34肺泡結構中斷，缺失

圖3 A． 乳頭為主型腺癌，HE染色（×3．0）；B． 對照乳頭為主型腺癌CD34標記的毛細血管網大部分中斷、消失（×3．0）；C． 實性為主型伴黏液產生微浸潤性癌，HE染色（×10．0）；D．對照實性為主型伴黏液產生微浸潤性癌CD34標記的毛細血管網絕大部分消失（×10．0）；E． 腺泡為主型腺癌（×10．0），HE染色；F． 對照腺泡為主腺癌CD34標記的肺泡結構大部分消失。G． 微乳頭為主型腺癌，HE染色（×3．0）；G． 對照微乳頭為主的腺癌CD34標記的毛細血管網部分中斷，消失（×3．0）

表1 各類型肺腺癌中CD34、P53、Ki67的表達與臨床病理特征的關系（%）

3 討論

近年來，我國肺癌發生概率呈現出上升趨勢。較多國家，腺癌已超過鱗狀細胞癌成為最常見的組織學亞型［2］。根據肺癌患者所處的腫瘤分期差異，與患者病情及身體耐受情況所選的治療方案有所不同，如化療、手術、放療及聯合放化療等，而患者的生存期也不同。大多數肺癌患者發現病患時已為晚期，失去手術治療機會，預后差，死亡率高，而據統計原位腺癌和微浸潤腺癌，患者手術后5年生存率為100%，手術切除范圍小，患者生活質量高［3］。因此，肺癌早期診斷及系統化治療方案對肺癌的治療起重要效果。其能夠增加肺癌患者的生存時間［4］。

從肺泡上皮腺瘤樣不典型增生（AAH）發展成為微浸潤腺癌，進而成為浸潤性腺癌的演變過程中，因原位腺癌發生時間長短不一，不同區域腫瘤形態有明顯差異，某些原位癌區域生長活躍，某些原位癌區域肺泡萎縮脫落，周圍肺間質纖維組織增生，而造成原有肺泡組織結構多形，而形成的假浸潤與腫瘤細胞推擠肺泡壁，使肺泡萎縮、塌陷進而腫瘤取代肺間隔纖維瘢痕的真浸潤相鑒別［1］。雖然世界衛生組織與國際多學科肺腺癌分類已經對肺腺癌制定了完整的分類標準，但在臨床工作中原位癌與微浸潤性腺癌、及前者與腺泡為主型腺癌的鑒別診斷經常會受到阻礙，尤其是與腺泡為主型的肺腺癌的鑒別困難，有時形態學難以具體體現或在制片過程中組織受到擠壓，及冰凍切片后剩余組織中，原位腺癌與浸潤性癌的形態重疊也會給病理醫師產生困惑。這時免疫組化指標CD34的染色結果，可以為評估肺泡結構提供額外的幫助。

CD34屬于血管內皮標志物。因在發育及成熟的個體中，一切血管內皮細胞均體現出CD34高表達狀態。因此，CD34通常被用于血管內皮細胞典型標志物。經免疫組化染色顯現血管內皮，能夠全面體現出肺腺癌腫瘤間質浸潤情況與腫瘤生物學特點，但在臨床病理診斷過程中，要排除肺纖維化等其他非腫瘤性導致肺泡結構破壞的情況。而同樣作為血管內皮免疫組化標記物，CD31曾被認為是一種最為敏感的血管內皮標志物，但其在造血組織如血小板、巨噬細胞和淋巴細胞等炎性細胞中也可以表達［5］，尤其在出血區域易著色，背景臟亂，及肺泡巨噬細胞豐富的病例時，CD31的染色結果可能會使人困惑［6］。F8是一種最早被運用到臨床的血管內皮標志物［7］，可以顯現大、小血管，在血管腫瘤中其陽性表達率可達95%［8］，但不能完整表達肺泡壁結構，尤其在組織擠壓變形更不易辨認。經臨床病理工作中發現，F8與CD31均不能較好顯示肺泡間隔氣體交換的毛細血管網，不能判斷肺泡壁結構存在與否。多種器官基底型上皮細胞和肌上皮細胞標記物CK5/6和p63在外周氣道上皮均有表達，但不表達于肺泡上皮細胞［9］。

研究證明，CD34通過顯示肺泡壁毛細血管網完整或消失幫助判別肺腺癌是否有浸潤是有臨床意義的。病理醫師遇到原位癌與腺泡型腺癌診斷困難，通過CD34診斷21例，原位癌與微浸潤性腺癌診斷困難14例，其他病例HE染色與CD34的免疫組化表達診斷一致。在表達為浸潤性腺癌的病例中淋巴結轉移、脈管癌栓、復發率與死亡率明顯高于早期腺癌（P<0.05）。TTF-1蛋白陽性顆粒定位于細胞核，Napsin-A陽性定位于胞質，在腺癌組織總體陽性率表達分別為100%和97.5%。Ki-67在浸潤性腺癌的陽性率明顯比早期腺癌的范圍高，P53在浸潤性腺癌的突變率比在腺癌的范圍高（P<0.01）。表明CD34在判斷肺腺癌是否有浸潤的臨床意義的準確性。綜上所述，隨著新版肺腺癌的推廣，長期的臨床實驗表明，免疫組化標記CD34在臨床早期肺癌與浸潤性肺癌的鑒別診斷起到了重要的作用，成為臨床早期肺癌有效的輔助診斷。