耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌外膜蛋白OprD2基因型的研究

陳詠君 郎華 徐芳芫 劉姝 趙男

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是一種條件致病菌,同時也是醫院感染的主要病原菌之一［1］。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用以及抗菌藥物使用量的不斷增加,多重耐藥銅綠假單胞菌(multi-drug resistance Pseudomonas aeruginosa,MDRP)及泛耐藥銅綠假單胞菌不斷產生［2］。亞胺培南屬于碳青霉烯類藥物中常用的一種,近年來,由于亞胺培南在臨床上的大量使用,導致耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌引起的感染不斷增多,這些問題已經成為威脅人們健康的重要公共衛生問題,同時耐藥菌的增加也是臨床治療的重要挑戰。尤其是由于我國抗生素的廣泛應用,使得我國部分細菌的耐藥顯著高于西方國家［3］。因此,檢測醫院內的耐藥情況,找尋其耐藥的機制,是亟待解決的問題。本研究對其耐藥機制進行了探討,旨在為臨床合理使用抗菌藥物治療銅綠假單胞菌的感染提供較有價值的依據。現對沈陽某教學醫院2017～2019年銅綠假單胞菌感染情況進行回顧性分析,并將收集的耐亞胺培南銅綠假單胞菌進行耐藥機制研究,結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集沈陽醫學院附屬第二醫院2017年1月～2019年12月所有臨床送檢樣本中分離的253 株銅綠假單胞菌,其中亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌15 株。來自同一患者相同部位的菌株只分析第1 株。標本包括痰、膿、咽拭子等。銅綠假單胞菌(ATCC27853)由衛健委臨床檢驗中心提供。

1.2 主要試劑與儀器 細菌基因提取試劑盒(上海生工有限公司)；Tag 酶及 PCR 相關試劑(上海生工有限公司)；PCR 引物(上海生工有限公司合成)；全自動微生物鑒定分析儀(法國生物梅里埃)、PCR 儀(上海宏石)、電泳儀(美國伯樂)、恒溫振蕩培養箱(上海)；超速低溫離心機(美國賽默飛)；紫外凝膠成像儀(美國 Alpha Innotech)。

1.3 引物設計與合成 根據GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 公布的基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件及參考文獻設計［4］,引物由上海生工生物工程有限公司合成,引物序列見表1。

表1 基因引物一覽表

1.4 方法

1.4.1 DNA 提取 嚴格按照操作說明提取基因組DNA。

1.4.2 PCR 擴增體系 擴增反應總體積為25 μl,DNA模板3 μl,上下引物各0.5 μl,2×TaqPCRMasTerMix 12.5 μl 加無菌去離子水至 25 μl。

1.4.3 PCR 反應條件 基因熱循環擴增條件：94℃預變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃ 延伸1 min,共30 個循環,最后72℃延伸10 min。

1.4.4 瓊脂糖凝膠電泳 1 g 瓊脂糖粉末與100 ml 0.5×TBE 緩沖液混合加熱煮沸,冷卻至80℃后,制備成1%的瓊脂糖凝膠。2 μl 上樣緩沖液與5 μl PCR 擴增產物混合后加入1%瓊脂糖凝膠孔,10×TBE 為電泳緩沖液,用水平式電泳槽140 V,電流為80 mA,時間為40 min。EB 染色20 min,300 nm 紫外燈觀察結果,凝膠成像系統成像。

2 結果

15 株亞胺培南耐藥銅綠假單胞菌檢出OprD2 基因5 株(見圖1)、blaVIM 基因4 株(見圖2)、blaOXA-10基因8 株(見圖3)；均未檢出blaGES、blaIMP、blaGIM、blzSIM、blaTEM、blaPER、blaVEB 基因。

圖1 OprD2 基因PCR 電泳擴增圖M:marker 1～15 為標本

圖2 VIM 基因PCR 電泳擴增圖M:marker 1～10 為標本

圖3 OXA-10 基因PCR 電泳擴增圖M:marker 1～10 為標本

3 討論

銅綠假單胞菌分布廣泛,廣泛分布于自然界、土壤、水、空氣、人體皮膚、腸道、呼吸道。同時銅綠假單胞菌也是臨床上最常見的條件致病菌之一,其以呼吸系統感染為主,現已成為醫院感染的主要病原菌之一［5,6］。最近一些年,碳青霉烯類廣譜抗生素在臨床的大量應用,導致臨床分離的耐碳青霉烯的銅綠假單胞菌出現上升現象。通過研究發現,銅綠假單胞菌的耐藥機制包括以下幾種［7,8］：①細菌產生滅活酶；②膜通透性下降；③抗菌藥物作用靶位改變；④細菌生物被膜形成；⑤基因突變；⑥獲得外源性耐藥基因；⑦其他耐藥機制。在以上的這些耐藥機制中,金屬β-內酰酶(MBL)是銅綠假單胞菌產生的最主要碳青霉烯酶,此耐藥機制可以水解除氨曲南以外所有β-內酰胺酶類抗生素。同時外膜孔蛋白OprD2 是碳青霉烯類抗生素進入菌體內的特異性通道,而外膜孔蛋白OprD2 的缺失將導致銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗生素產生耐藥［9］。對于耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌國內外的研究如下：國際方面已經檢出blaIMP、blaVIMb、blaSIM、blaSPM、blaGIM、blsAIM 基因,而國內關于銅綠假單胞菌的研究是已檢出blaIMP、blaVIM、blaSPM 基因,其中blaIMP、blaVIM 這兩個基因檢出較多［10-12］。

有研究表明,耐碳青霉烯酶的銅綠假單胞菌的分離率每年都在增長,本次研究中痰液標本分離率為最高,這和陶春梅等［13］的報道結果相符。本此研究藥敏試驗結果顯示,2017年1月～2019年12月,沈陽醫學院附屬第二醫院共分離出253 株銅綠假單胞菌。這253 株銅綠假單胞菌感染主要以痰標本為主,共240 株,所占比例為94.9%；其次是尿液6 株,所占比例為2.4%；分泌物3 株,所占比例為1.2%；膿汁2 株,所占比例為0.8%。從病房的分布情況來看,檢出菌株率分別是呼吸、干診三病房、冠心病監護病房(CCU)、干病房、神經外科病房等。其中呼吸病房共檢出68 株,占26.9%；干三病房共檢出67 株,占26.5%；CCU 共檢出29 株,占11.5%。其中慶大霉素、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率均較高,在2018年慶大霉素的耐藥率達到63.5%,為耐藥率最高；多粘菌素B 為3年來耐藥率最低。回顧性分析過去3年本院的耐藥情況,總體在2019年得到有效控制。這和醫院這些年對于耐藥問題的重視有關,積極控制抗生素的使用有很大的關系［14］。

本研究中15 株耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌攜帶耐藥基因結果如下：其中外膜孔蛋白 OprD2 缺失5 株,攜帶率為33.3%；VIM 型陽性4 株,攜帶率為26.7%；OXA-10 型陽性8 株,攜帶率為53.3%；未擴增出其他基因型。外膜孔蛋白OprD2 是一類底物特異性蛋白,它可促進碳青霉烯類藥物、氨基酸等進入細胞,外膜孔蛋白OprD2 基因缺失或降低可以使抗生素不能進入到指定的部位發揮其作用,從而增加銅綠假單胞菌對碳青霉烯酶類藥物產生的耐藥機制［15,16］。本次研究中檢測出外膜孔蛋白OprD2 缺失5 株,說明外膜孔蛋白OprD2 缺失可能是沈陽醫學院附屬第二醫院銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物耐藥的重要原因之一。同時本次研究中外膜孔蛋白OprD2 基因缺失率與韋柳華［17］報道的16.13%的報道相接近,但是與華東地區的袁莉莉等［18］報道的缺失率85.6%和黑龍江地區的劉沫然等［19］報道的缺失率86.3%存在一定差異。這可能與菌株來源、標本收集例數、臨床用藥習慣、醫院對于院感重視程度等一系列原因有關。目前認為MDRP 對碳青霉烯類藥物耐藥的機制非常復雜,在本次研究中發現攜帶OXA-10 耐藥基因的細菌8 株,這說明了可能產抗生素水解酶耐藥機制在本研究菌株介導的耐藥過程中占主導地位,對于本院銅綠假單胞菌產抗生素水解酶耐藥機制,會在后續研究中報道。雖然有研究指出產生金屬酶和外膜孔蛋白OprD2 缺失是引起銅綠假單胞菌對碳青霉烯酶耐藥的主要原因［20,21］,但是這種現象與本研究還是存在一定的差異,本研究外膜孔蛋白OprD2 基因缺失是引起銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥的主要原因之一。

本此研究結果顯示,2017～2019年沈陽醫學院附屬第二醫院收集的15 株耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌中,發現個別菌株未出現 OprD2 基因的缺失,也未出現金屬酶耐藥機制,在本次研究耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌中,可能有其他耐藥機制的存在,例如主動外排系統的過度表達；或者是生物膜的形成,使抗菌藥物不能有效到達作用部位等。對于這些菌株將在后續的研究中,為臨床及醫院的感染控制提供依據,同時也可對耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌耐藥機制進行更深一步的研究。

綜上所述,由于抗生素的大量使用,耐碳青霉烯酶銅綠假單胞菌引起的醫院感染變得每日俱增,這已經成為臨床科室必須要面對的一個非常嚴重的問題。因此,醫院應加強對碳青霉烯酶耐藥銅綠假單胞菌耐藥機制的檢測和監控,合理使用抗生素。