大花序桉基因組SSR的分布特征及序列分析

邱炳發 梁馨元 王建忠 白天道 蔣維昕

摘要：【目的】分析大花序桉基因組SSR的分布特征及序列分析，為大規模開發大花序桉分子標記輔助育種的SSR標記提供理論依據。【方法】通過高通量測序獲得大花序桉基因組序列信息，經嚴格過濾、拼接和組裝后獲得scaffolds，利用MISA網站對Scaffolds進行SSR位點檢索及分析，并利用Primer 5.0對具有較大多態性開發潛力（二基元重復次數≥10、三基元重復次數≥7）的SSR標記進行引物設計，隨機挑選48對基因組SSR引物進行有效性檢測及有效擴增引物篩選。【結果】大花序桉基因組共含有177750個SSR位點，包括171530個SSR獨立位點和6220個復合型SSR位點;SSR發生頻率為17.86%，分布密度為1/3.13 kb。大花序桉基因組SSR基元類型較豐富，以單核苷酸重復基元類型數量最多，占基因組總SSR數量的69.33%，其次為二、三核苷酸重復基元類型，分別占基因組SSR數量的21.01%和7.58%，四、五、六核苷酸的重復基元類型所占比例均相對較低，三者的比例含量總和為2.08%。SSR基元類型以AG/CT占絕對優勢（16812個），其次為AT/AT（8193個）和AAG/CTT（4404個）。從48對SSR標記引物中篩選出31對引物能有效擴增出清晰、明亮條帶且大小與預期相符，其中有14對在6個大花序桉樣本中均呈現多態性，多態百分率為29.17%。【結論】大花序桉基因組SSR位點發生頻率高，基元類型較豐富，SSR多態性標記開發潛力大。該研究結果為進一步大花序桉SSR引物開發和篩選，以及開展大花序桉及其他桉樹遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構建提供依據。

關鍵詞：大花序桉;基因組;SSR;重復基元;多態性

中圖分類號：S792.39;S718.46? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）10-2744-07

Abstract：【Objective】 The distribution patterns and sequence characterstics of simple sequence repeat （SSR） in Eucalyptus cloeziana genome were analyzed in order to lay the foundation for developing SSR markers in molecular marker-assisted breeding of E. cloeziana. 【Method】 The genome sequence information of E. cloeziana was obtained based on high-throughput sequencing. Scaffold sequences were identified after rigorous filtration， splicing and assembly. The SSR loci from Scaffolds were searched and analyzed by using MicroSAtellite （MISA）. Primer 5.0 software was used to design the SSR sequences with high potential for polymorphism development （the repetitions of dinucleotide ≥10， the repetitions of trinucleotides ≥7）. Forty-eight genomic SSR primer pairs were randomly selected for validity detection and screening of primers successfully amplicated. 【Result】 The genome of E. cloeziana contained 177750 SSR loci， including 171530 single SSRs and 6220 compound-loci SSRs. The SSR occurrence frequency was 17.86% and the distribution density was 1/3.13 kb. There were abundant SSR motifs in E. cloeziana genome， and among them， the mononucleotide repeats were the most abundant types， accounting for 69.33% of the total genomic SSRs， followed by dinucleotide and trinucleotide repeats， accounting for 21.01% and 7.58%， respectively. The proportions of tetra-， penta- and hexa-nucleotide repeats were relatively low， and the total proportion of the three nucleotides was 2.08%. For the SSR motifs， AG/CT were the dominant primitive types （16812），followed by AT/AT （8193）， AAG/CTT （4404）. A total of 48 SSR marker pairs were randomly selected for initial screening test. Thirty-one primers pairs could effectively amplify clear and bright bands matching the expected size， and 14 of them showed polymorphism across six samples of E. cloeziana. The percentage of polymorphic loci was 29.17%. 【Conclusion】 The SSR loci in the genome of E. cloeziana occur in high frequency and abundant motifs， and exhibit great potential for developing polymorphic SSR markers. Therefore， the results provide a basis for further SSR development and screening，genetic diversity analysis and genetic mapping of E. cloeziana and other Eucalyptus trees.

Key words：Eucalyptus cloeziana; genome; SSR; repeat motif; polymorphism

Foundation item： Key Research and Development Project of Guangxi（2018AB44025）; Guangxi Forestry Science and Technology Project （Guilinkezi 〔2016〕 2）;Science Research Foundation of Guangxi University （20180493）

0 引言

【研究意義】大花序桉（Eucalyptus cloeziana F. Muell）為桃金娘科（Myrtaceae）桉屬（Eucalyptus）昆士蘭桉亞屬的大型喬木，天然分布于海拔25～ 950 m的澳大利亞昆士蘭州中和北部區域（144°44′～152°52′E，15°45′～26°41′S）（祁述雄，2002）。該樹種材干通直、木材硬度高、尖削度低，自然整枝良好，木材的花紋美觀，紋理和結構均勻，耐久性沉重，鋸材性能優良，是一種用于制作高檔實木家具的優良材料，且在輪伐期具有較強的木材生長潛力和材質特性，成熟階段材積生長顯著（祁述雄，2002;李昌榮等，2012），其經濟價值遠高于短輪伐期的普通桉樹，目前已被納入我國珍貴用材樹種之一（黃振等，2018）。利用高通量測序技術平臺獲得大花序桉全基因組數據，挖掘其SSR位點，分析其分布特征，并開發SSR引物，對大花序桉遺傳結構分析、指紋圖譜構建、分子標記輔助選育等均具有重要意義。【前人研究進展】合理選擇遺傳標記是群體遺傳學及分子標記輔助育種研究的重要保證。SSR標記為共顯性標記，具有擴增穩定、數量豐富、多態性高及特異性強等優勢，廣泛應用于桉樹遺傳多樣性評價、無性系指紋圖譜構建、遺傳作圖、物種鑒定、親本指派及QTLs定位等研究（Kirst et al.，2005;Shepherd and Raymond，2010;Subashini et al.，2014;Lv et al.，2020）。基于基因組開發的SSR（gSSR）標記相對轉錄組開發的SSR（EST-SSR）具有較高的多態性（Liu et al.，2018）。gSSR為中性標記，與任何特定的性狀均無關聯，但最能反映出一個野生種群所潛在的全部遺傳多樣性（Zonneveld et al.，2012）。不同桉樹基因組中SSR分布特征有所不同，對NCBI、FORESTS等公共數據庫內藍桉（E. globulus）、尾葉桉（E. urophylla）和巨桉（E. grandis）等重要桉樹的基因組或轉錄組SSR序列分析結果表明，桉樹SSR發生頻率通常為12.3%～25.5%，以AG/TC和CCG/GGC分別為二、三基元重復優勢類型（Ceresini et al.，2005; Yasodha et al.，2008;Sumathi and Yasodha，2014;Liu et al.，2018）;而在蘋果桉（E. gunnii）（Rengel et al.，2009）和赤桉（E. camaldulensis）（Hirakawa et al.，2011）的基因組SSR三基元類型中，則以AAG/CTT最為豐富。部分學者也利用NCBI數據庫開發出大量桉樹SSR標記，但這些SSR標記在大花序桉中表現出較低的通用率（Nevill et al.，2008; Zhou et al.，2014）。近年來，研究人員基于巨桉、赤桉、尾葉桉等重要近源桉樹開發的SSR標記開展了大花序桉遺傳變異的研究（鄧紫宇等，2019;Lv et al.，2020）。【本研究切入點】根據已有的桉屬樹種系統進化分析結果表明，大花序桉與同屬其他桉樹存在較遠的親緣關系，為獨立的亞屬分支（Steane et al.，2011），因而針對該樹種的基因組或轉錄組進行SSR標記研究將有助于進一步探究其分子遺傳學特性。但迄今為止，鮮見大花序桉SSR分布特征及標記開發的研究報道。【擬解決的關鍵問題】通過高通量測序獲得大花序桉基因組序列信息，經嚴格過濾、拼接和組裝后獲得scaffolds，利用MISA網站對Scaffolds進行SSR位點檢索及分析，并利用Primer 5.0對具有較大多態性開發潛力（二基元重復次數≥10、三基元重復次數≥7）的SSR序列進行引物設計，隨機挑選48對基因組SSR引物進行有效性檢測及有效擴增引物篩選，以期開發大花序桉SSR標記，為大花序桉種質資源鑒定、遺傳多樣性及分子標記輔助育種打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

高通量測序所用材料為2年生大花序桉頂芽，采集自廣西崇左市扶綏縣國有東門林場大花序桉種源試驗林基地（107°14′108.00″E，22°17′22.30″N）。樣品采集后迅速投入液氮速凍保存，由上海歐易生物醫學科技有限公司提取其基因組DNA并建庫，通過Illumina HiSeq X Ten高通量測序平臺進行雙端測序。后續SSR引物擴增所用樣本為6株大花序桉新鮮葉片，隨機采自廣西東門林場以實生苗營造的3年生大花序桉子代試驗林。該試驗林種子來自澳大利亞昆士蘭州的大花序桉天然母樹林。采集后于干冰保存帶回實驗室-80 ℃保存。基因組DNA快速提取試劑盒及PCR Mix均購自北京擎科新業生物技術有限公司。

1. 2 基因組SSR標記開發及引物設計

采用Trimmomati對高通量測序的原始數據進行嚴格過濾和質量評估（Bolger et al.，2014），獲得高質量的clean reads，將clean reads之間重疊區域拼接形成contigs，再根據序列信息將contigs組裝成更長的scaffolds（Xie et al.，2014）。基于MISA（http：//pgrc. ipk-gatersleben.de/misa/）網站對大花序桉全部scaffolds進行SSR位點檢索及分析。SSR搜索參數設置標準如下：重復基元1～6 bp，分別代表單核苷酸～六核苷酸，各核苷酸類型最小重復次數分別為10、6、5、5、5和5次，復合型SSR的檢索條件是2個SSR片段間的距離低于100 bp。利用Primer 5.0對含有SSR且位點上、下游序列≥100 bp 的二基元（重復次數≥10次）、三基元（重復次數≥7次）核苷酸重復序列進行引物批量設計。參數設置為：SSR引物長度為18～22 bp;退火溫度（Tm）為58～62 ℃，且上、下游引物相差的退火溫度<2 ℃;PCR產物片段長度為100～350 bp，G+C含量為50%～55%;避免引物二級結構。

1. 3 PCR擴增及SSR引物有效性驗證

隨機挑選48對基因組SSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用基因組DNA快速提取試劑盒提取6株大花序桉新鮮葉片的基因組DNA，以其為模板進行PCR擴增。反應體系10.0 μL：10×Buffer 1.0 μL，dNTPs終濃度200 μmol/L，正、反向引物終濃度0.40 μmol/L，Taq DNA聚合酶1 U，DNA模板5 ng，ddH2O定容至10.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性6 min;95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進行35個循環;72 ℃延伸 5 min，最后4 ℃保存。擴增產物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色，拍照保存，統計其中能夠穩定擴增、條帶明亮且符合預期目的片段大小。

2 結果與分析

2. 1 大花序桉基因組SSR的重復基元類型

對大花序桉進行基因組測序，經拼接、組裝后獲得995093條Scaffolds，總長度556992 kb。通過MISA網站對全部Scaffolds進行SSR位點檢索，共獲得177750個SSR位點，包括171530個SSR獨立位點和6220個復合型SSR位點（表1）。由表1可知，大花序桉基因組SSR發生頻率為17.86%，SSR位點分布密度為1/3.13 kb;大花序桉基因組重復基元類型較豐富，以單核苷酸的重復基元類型數量最多，分別占基因組SSR數量69.33%（118918個SSR位點），其次為二、三核苷酸的重復基元類型，占基因組SSR數量的21.01%（36036個SSR位點）和7.58%（13007個SSR位點）;四、五、六核苷酸的重復基元類型所占比例均相對較低，三者的比例含量總和為2.08%（共3569個SSR位點）。總整來看，含SSR位點的序列數量隨核苷酸基元堿基數的增加逐漸減小。

2. 2 大花序桉基因組SSR的重復基元堿基構成

對大花序桉基因組中52612個二核苷酸～六核苷酸重復基元進一步分析，結果共發現138種重復基元類型，比例最高的20種類型SSR（圖1）共計43618個（占82.91%）。在這些核苷酸重復類型中，二核苷酸基元重復類型中以AG/CT占絕對優勢（共16812個，占31.95%），其次為AT/AT（共8193個，占15.57%）和AC/GT基元類型（共2863個，占5.44%）;三核苷酸重復類型中則以AAG/CTT（共4404個，占8.37%）為優勢重復基元類型，其次為AAT/ATT（4.93%）、AGG/CCT（2.91%）和CCG/CGG（2.86%）基元類型;大花序桉基因組SSR中四、五、六核苷酸重復基元雖然類型也較豐富，但占SSR位點總數的比例較低，且其中有76種基元類型僅出現1次。

2. 3 大花序桉基因組SSR基元重復次數分布

大花序桉基因組各類型核苷酸重復基元的數量和比例隨著基元重復次數的增加而逐漸降低（圖2）。除去單核苷酸類型，大花序桉基因組不同SSR類型重復次數主要集中于5～11次之間，占獨立位點SSR總數的79.89%（表3）;重復次數≥12的SSR位點以二核苷酸類型SSR為優勢，占19.29%（10151個），其中，高重復次數（≥20次）的SSR位點數共983個。在大花序桉基因組所有類型SSR序列中，占比例最高的重復次數依次為6次、5次、7次和8次重復類型，分別為12333、8276、7382和5049個，各占SSR總數的23.44%、16.58%、14.03%和9.60%。

2. 4 大花序桉基因組SSR重復片段長度

由于SSR序列長度≥20 bp時具有較高多態性，是理想的標記位點;序列長度在12～20 bp之間時標記多態性適中;<12 bp時SSR標記的多態性表現極低（Temnykh et al.，2001），因此本研究選取≥12 bp的二～六核苷酸重復基元作進一步片段長度分析，結果圖3所示。大花序桉基因組SSR重復片段的長度變化規律和基元重復次數一致，SSR序列長度主要集中于12～20 bp，為38735個，占SSR總數的73.26%;分布于21～28 bp的SSR數量為9868個，占SSR總數的18.66%;≥30 bp以上的SSR數量為4265個，占SSR總數的8.07%。另外，大花序桉基因組SSR最長重復片段為三核苷酸類型ATT/AAT（102～111 bp），出現次數為7。總整來看，大花序桉SSR長度主要集中在中等多態性長度，具有較大的多態性標記開發潛力。

2. 5 大花序桉基因組SSR標記的擴增有效性檢測結果

對大花序桉基因組中具有較大多態性開發潛力的10585個SSR標記進行引物設計，從中隨機挑選48對SSR標記引物，以6株大花序桉新鮮葉片DNA為模板進行PCR擴增，并從中篩選擴增效果較好且符合預期大小的引物。由圖4可知，有31對引物能有效擴增出清晰、明亮條帶，且大小與預期相符（表2），其中有14對引物在6株大花序桉中擴增出多態性條帶，多態百分率為29.17%，8對引物擴增效果不佳或擴增出非目的條帶，9對引物未擴增出條帶。結合表2還可知，未呈現多態性的SSR基元重復次數為7～33次;呈現多態性的SSR位點中，除復合型位點Ec015外，二基元類型占85.71%，重復次數為16～44次;三基元類型僅有一個SSR位點（即Ec007），重復次數為34次。

3 討論

經本研究分析發現，大花序桉基因組177750個SSR位點，SSR分布密度為1/3.13 kb，發生頻率為17.86%，高于赤桉（E. camaldulensis）的SSR分布密度（1/7.1 kb）（Hirakawa et al.，2011）以及基于NCBI數據庫分析的巨桉（E. grandis）（11.8%）、蘋果桉（E. gunnii）（4.6%）和細葉桉（E. tereticornis）（8.3%）EST-SSR發生頻率（Yasodha et al.，2008），但低于基于FORESTs數據庫分析的巨桉、赤桉、藍桉等EST-SSR分布頻率（25.6%和25.6%）（Ceresini et al.，2005;Rabello et al.，2005）。可見，不同樹種基因組中SSR的分布特征存在較大的差異，相對于其他桉樹，大花序桉基因組中SSR發生頻率處于中等水平。Varshney等（2005）研究認為，SSR分布頻度之所以出現差異，除了物種間差異因素外，還與測序數據深度、序列拼接數據質量及SSR位點查找軟件以及SSR搜索標準不同有關。

單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重復基元是絕大多植物基因組SSR序列中優勢重復類型（Biet et al.，1999）。本研究發現，大花桉基因組SSRs中，單、二和三核苷酸重復基元類型分別占基因組SSR數量的69.33%、21.01%和7.58%，且二核苷酸基元類型以AG/CT為優勢重復基元（16812個，占31.95%），該結果和絕大部分植物中觀測到的結果一致（Sumathi and Yasodha，2014）。而三核苷酸重復基元優勢類型則因物種而異（Victoria et al.，2011）。本研究中，大花序桉SSR序列中三核苷酸重復類型占比從高至低依次為AAG/CTT（8.37%）、AAT/ATT（4.93%）、AGG/CCT（2.91%）和CCG/CGG（2.86%），與蘋果桉（E. gunnii）（Rengel et al.，2009）和赤桉（E. camaldulensis）（Hirakawa et al.，2011）的基因組SSR三核苷酸重復類型中AAG/CTT為優勢重復基元類型的結論一致。但藍桉、尾葉桉、巨桉及細葉桉等桉樹基因組SSR三核苷酸重復類型中CCG/GGC為優勢重復基元類型（Ceresini et al.，2005;Yasodha et al.，2008;Sumathi and Yasodha，2014;Liu et al.，2018）。對于大花序桉而言，其根部轉錄組三核苷酸重復序列中CCG/GGC也為優勢類型（朱林生等，2018）。上述基因組和轉錄組間的差異間接反映了三核苷酸重復類型SSR在桉樹基因組上分布不隨機。

研究表明，SSR基元重復次數越高，多態性標記的開發潛力越大，尤其當基元的重復次數≥12次或片段長度≥20 bp時多態信息含量（PIC）較高（Thao et al.，2013）。本研究對大花序桉基因組中具有較大多態性開發潛力的10585個SSR序列（二基元重復次數≥10、三基元重復次數≥7）進行引物設計，從中隨機挑選48對基因組SSR標記引物進行初篩選，結果發現有31對引物能有效擴增，其中有14對引物在6株大花序桉中均呈現多態性。進一步將多態與非多態SSR位點基元重復次數進行比較，結果發現重復次數最高的SSR并非一定表現出多態性，但從占比最高的二基元類型分析，SSR長度≤30 bp（或重復次數小于16次）的位點多態性表現極低。本研究得出，大花序桉基因組SSR引物的多態百分率為29.17%，與E. victrix（33.33%）（Nevill et al.，2013）和E. gomphocephala（25%）（Bradbury et al.，2013）的多態百分率相近，但遠低于赤桉（E. camaldulensis）（56%）（Silva et al.，2009）的多態百分率。今后應對大花序桉群體的多態信息含量（PIC）、觀察等位基因數（Na）、有效等位基因數（Ne）、期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）進行深入研究，為群體遺傳學分析和分子標記輔助育種打下理論基礎。

4 結論

花序桉基因組SSR位點發生頻率高，基元類型較豐富，SSR多態性標記開發潛力大。該研究結果為大花序桉SSR引物開發和篩選，以及開展大花序桉及其他桉樹遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構建提供依據。

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（責任編輯 陳 燕）