一株抗南方根結線蟲長形賴氨酸芽孢桿菌的分離鑒定及應用

程菊娥 王東偉 成飛雪 朱春暉 王忠勇 史曉斌 鄭立敏 蘇品 劉勇 張德詠

摘要：【目的】篩選對南方根結線蟲具有良好活性的生防菌株，為殺線蟲制劑的研制與應用提供理論依據。【方法】采用平板稀釋法對從抗線蟲黃瓜根系附近采集的土壤樣品進行芽孢桿菌分離，通過浸漬法篩選出殺線活性高且穩定的菌株，結合形態特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析對活性菌株進行分類鑒定，并通過離體、盆栽及田間試驗對分離菌株防治南方根結線蟲的效果進行驗證。【結果】篩選出1株具有較高殺線蟲活性的芽孢桿菌C1，經鑒定菌株C1為長形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus macroides）。殺線活性測定結果表明，菌株C1發酵上清液對南方根結線蟲卵孵化的相對抑制率為74.50%、對雌蟲孵化的相對抑制率為95.17%、對2齡幼蟲的24和48 h校正死亡率分別為98.83%和100.00%，且殺蟲活性穩定;盆栽試驗發現，菌株C1發酵液50倍稀釋液對番茄南方根結線蟲的防效為73.24%;田間防病試驗結果顯示，菌株C1發酵液50倍稀釋液對黃瓜南方根結線蟲病的防效達82.67%，且產量較清水對照增產20.0%。【結論】菌株C1不僅對南方根結線蟲病具有良好的防治效果，且能促進作物生長，可作為生物農藥和肥料在農業生產中開發利用。

關鍵詞： 南方根結線蟲;長形賴氨酸芽孢桿菌;鑒定;殺線活性;促生效果

中圖分類號： S432.45? ? ? ? ? ?   ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）10-2765-11

Abstract： 【Objective】To screen the biocontrol strains with good activity against Meloidogyne incognita and provide a theoretical basis for the development and application of nematicidal agents.【Method】Bacillus was isolated from soil samples collected near the root of cucumber resistant to M. incognita by plate dilution method. Strains with high and stable nematicidal activity were screened by impregnation method. The active strains were classified and identified based on morphological characteristics， physiology and biochemistry and 16S rDNA identification. In vivo， pot and field experiments were conducted to verify the effect of the isolated strain on the control of M. incognita. 【Result】A Bacillus C1 with high nematicidal activity was screened， and the strain C1 was identified as Lysinibacillus macrolides. The nematicidal activity results showed that the relative inhibition rate of the fermentation supernatant of strain C1 on the egg hatching of M. incognita was 74.50%， the relative inhibition rate on the female hatching was 95.17%， and the 24 and 48 h corrected mortality of the second-stage juvenile were 98.83% and 100.00%， respectively， with stable nematicidal activity. Pot experiment showed that the control effect of 50 times dilution of fermentation broth of strain C1 on tomato M. incognita was 73.24%. The results of field disease control experiment showed that the control effect of 50 times dilution of C1 fermentation broth on cucumber M. incognita was 82.67%， with yield 20.0% higher than that of clear water control.? 【Conclusion】Strain C1 not only shows good control effect on M. incognita， but also promotes crop growth. It can be developed and utilized as biological pesticide and fertilizer in agricultural production.

Key words： Meloidogyne incognita; Lysinibacillus macrolides; identification; nematicidal activity; growth promoting effect

Foundation item：Special Construction Project of China National Modern Agricultural Industrial Technology System （CARS-16-E17）; National Natural Science Foundation of China（31401797， 31871941）

0 引言

【研究意義】植物根結線蟲是一類普遍發生的專性植物寄生病原線蟲，可對3000多種植物的生長發育造成嚴重危害（劉維志，1998;Jones et al.，2013），每年由根結線蟲等植物寄生線蟲造成的經濟損失約1500億美元（Li et al.，2015），被認為是最嚴重的寄生線蟲（段玉璽，2011）。近年來，隨著我國蔬菜和糧食作物種植面積不斷擴大、全球氣候變暖以及規模化集約農業的發展，根結線蟲病害愈發嚴重，對糧食和蔬菜等作物造成嚴重影響，受根結線蟲侵染的作物生長發育緩慢、產量顯著下降，嚴重制約了我國農業經濟的發展。由于缺乏抗性品種、復種指數高等原因，現階段根結線蟲的治理主要應用化學方式，化學防治雖然可獲得較突出的效果，但由于化學藥劑存在諸多缺點，如污染生態環境、毒性較高等，導致根結線蟲產生一定的抗藥性。尤其在2009年哥本哈根聯合國氣候變化大會召開后，世界各國均在追求低碳環保發展，一些對生態環境污染較嚴重的高毒藥物被禁用，生物防治由于其生態友好性而為人們所重視（路雪君等，2010;張楠，2017;Gogoi and sarodee，2019;程萬里等，2020）。南方根結線蟲是我國分布最廣和危害最嚴重的一類植物寄生線蟲（葛俊杰等，2016;舒然等，2020），目前化學防治是其主要防治方法，迫切需要經濟有效且對環境友好的防治根結線蟲綠色生物農藥。因此，利用微生物及其代謝產物防治南方根結線蟲既能殺滅線蟲，又符合生態友好的發展趨勢，但仍需挖掘更多的生防資源并應用于生產實踐。【前人研究進展】根結線蟲生防資源包括真菌、細菌、放線菌、植物、病毒和捕食性線蟲等，其中根際細菌是當前的熱點和主要研究方向（程菊娥和孔曉婷，2017）。在根際細菌中，對線蟲有活性的多為促生細菌，主要包括芽孢桿菌屬和假單胞菌屬（Siddiqui and Mahmood，1999）。Mahgoob和El-Tayeb（2010）利用多粘菌UBF15、巨型芽孢桿菌UBF10和圓球芽孢桿菌UBF20等根際細菌進行殺線蟲試驗，結果表明UBF15、UBF10和UBF20菌株混合處理能顯著減少線蟲在根和土壤中的繁殖，接種后90 d較未接種的對照根中根結、卵塊、幼蟲和雌蟲數量分別減少74.8%、79.5%、76.8%和53.3%。丁磊（2017）研究發現，根際細菌嗜線蟲沙雷氏菌PFMP-5在24 h內對根結線蟲卵的孵化抑制率可達93%以上。呂達（2017）從山東省萊蕪市大姜種植區土壤中分離出23株細菌，其中菌株E5、E9和E17發酵液對南方根結線蟲的防效均在98%以上。趙丹（2018）使用5種高效根際細菌對番茄種子處理可高效防治南方根結線蟲病，其中變形斑沙雷氏菌處理番茄種子防治根結線蟲為首次報道。杜珊珊（2018）從煙臺棲霞和姜疃鎮西洋參地土壤中分離出136株細菌，其中11株細菌對南方根結線蟲2齡幼蟲（J2）的校正死亡率均在80%以上。趙惠（2018）從北方線蟲研究所分離的1458株細菌中篩選出2株對蔬菜根結線蟲有良好防效的菌株Sneb811和Sneb709，其校正死亡率分別為98.17%（48 h）和98.09%（48 h），經鑒定Sneb811為莓實假單胞菌、Sneb709為解淀粉芽胞桿菌。劉廣穎（2020）從線蟲發生地分離到包括短小芽孢桿菌DDWD、耐鹽芽孢桿菌DDWA、芽孢桿菌DDWB、蠟樣芽孢桿菌 DDWWAI、海泥芽孢桿菌DDWC、銅綠假單胞菌JNB、東洋芽孢桿菌DDWNEI和假蕈狀芽孢桿菌JNC等8株具有殺線蟲活性的根際細菌，其中菌株DDWC對南方根結線蟲的防效達69.96%。【本研究切入點】目前只有蠟樣芽孢桿菌、堅強芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌等極少數生防菌登記應用于根結線蟲防治，難以滿足市場需求。【擬解決的關鍵問題】采用平板稀釋法對從抗線蟲黃瓜根系附近采集的土壤樣品進行芽孢桿菌分離，對篩選獲得的菌株進行形態特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析，進一步通過離體、盆栽和大田試驗評價分離菌株對南方根結線蟲的防治效果及對作物的促生作用，為殺線蟲制劑的研制與應用提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

1. 1. 1 供試土壤樣品 2018年7月在湖南省長沙縣春華基地黃瓜地塊，用取樣器（長55 cm，直徑2 cm）在抗線蟲黃瓜根系附近選5點取土壤樣品，深度10 cm，經篩取后將樣品混合裝袋。

1. 1. 2 供試根結線蟲雌蟲、蟲卵和2齡幼蟲的準備

參照劉維志（1998）的方法，將南方根結線蟲用感病寄主在室內盆栽接種擴大培養，在根系有大量雌蟲出現時，將根系用水輕輕沖洗，小心挑取雌蟲;將雌蟲放在0.5%次氯酸鈉溶液中消毒3 min，再用無菌水沖洗3次，放在盛有少量無菌水的培養皿內，25 ℃培養4 d，每隔24 h收集一次新孵化的根結線蟲2齡幼蟲，配制根結線蟲液（1000條/mL），4 ℃保存備用;將被南方根結線蟲侵染的根全部剪碎，并直接放置于三角瓶內，然后將100 mL 0.5%次氯酸鈉溶液倒入其中，振蕩2 min，再倒進200/500目篩組中，通過自來水沖洗，對500目篩網中包含的卵進行收集，最后對卵進行稀釋處理，制備1000粒/mL的卵懸浮液。

1. 1. 3 培養基 牛肉膏蛋白胨固體培養基（NA培養基）：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，加水至1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃條件下滅菌30 min。NA液體培養基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖2.5 g，加水至1000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

1. 1. 4 主要試劑 細菌基因組DNA提取試劑盒（福際生物技術有限公司），2×Es Taq Master Mix（康為世紀生物科技有限公司），細菌通用引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]，其他試劑均為國產分析純。

1. 1. 5 主要儀器 OLYMPUS SZ51顯微鏡;OLYM PUS SX23顯微鏡;Eppendorf 5430R離心機（南京伊若達儀器設備有限公司）;LRH-250恒溫生化培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）;全波長微孔板分光光度計（Bio Tek/Eon，美國）;W-CJ-FD超凈工作臺（上海博迅實業有限公司）;掃描電子顯微鏡（JEXL-230，日本電子株式會社），ZD-85振蕩培養箱（江蘇金壇市醫療器械廠）;凝膠成像儀（UVP凝膠成像系統，美國UVP公司）;BKQ-B100II全自動內循環立式高壓蒸汽滅菌器（濟南歐萊博科學儀器有限公司）;Eppendorf 5331 PCR儀（上海實維實驗儀器技術有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 芽孢桿菌分離 參照張立強等（2014）的平板稀釋法，將土壤配制成10-2～10-6懸浮液，分別取100 μL梯度懸浮液涂布于NA培養基上，30 ℃恒溫條件下培養2～4 d，挑選形態各異的單菌落，在純化培養基上進行劃線處理，得到純培養的單菌落，對菌株進行編號處理，-80 ℃甘油中保藏。

1. 2. 2 芽孢桿菌發酵液及發酵上清液制備 將通過活化處理的單菌落接種于發酵培養基中，30 ℃下180～220 r/min振蕩培養1～2 d，部分備用;另一部分30 ℃下8000～10000 r/min離心，上清液于4 ℃保存備用。

1. 2. 3 殺線蟲活性芽孢桿菌篩選 采用Giannakou等（2005）的浸漬法，將900 μL芽孢桿菌發酵上清液與100 μL根結線J2懸浮液分別添加至24孔板的空穴中，4次重復。25 ℃培養箱中培養24和48 h后，參考孫海等（2020）的方法在體視顯微鏡下觀察并記錄線蟲死亡數，計算校正死亡率。設NA液體培養基為對照。

死亡率（%）=死亡的線蟲數/觀察的線蟲總數×100

校正死亡率（%）=（處理線蟲死亡率-對照線蟲死亡率）/（100-對照線蟲死亡率）×100

1. 2. 4 活性菌株穩定性測定 選取活性菌株，將其涂布于NA培養基上，連續繼代培養5代后對各菌株的抗根結線蟲活性進行測定，具體操作方式同1.2.3。

1. 2. 5 活性菌株鑒定

1. 2. 5. 1 培養及形態特征 參照成飛雪等（2011）的方法，30 ℃恒溫條件下培養24～48 h后觀察菌落大小、顏色、質地、形狀和濕潤度等。另取對數生長期的新鮮菌體于1000 r/min下離心8 min，去掉上清液后收集菌體，再經2.5%戊二醛固定后用于電鏡觀察（李培京，2008）。

1. 2. 5. 2 生理生化特性測定 依據《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠和蔡妙英，2001）進行菌株生理生化特性鑒定。

1. 2. 5. 3 分子生物學鑒定 參考陳麗潔等（2019）的方法，基于菌株測序結果利用MEGA 7.0建構系統發育進化樹。

1. 2. 6 活性菌株發酵上清液對南方根結線蟲卵孵化的抑制效果 將菌株發酵上清液配制成原液、5倍和10倍稀釋液3個梯度（依次記為處理1～處理3），于24孔板中分別加入900 μL不同梯度的發酵液和100 μL蟲卵懸浮液，混勻，各處理重復3次，以NA液體培養基為對照（處理4，CK）;25 ℃處理5 d后于體式顯微鏡下觀察計數，計算南方根結線蟲卵孵化率和相對抑制率。

1. 2. 7 活性菌株發酵上清液對根結線蟲雌蟲孵化的抑制效果 試驗設2個處理，處理1：菌株發酵上清液處理，挑選大小相似、新鮮飽滿的南方根結線蟲雌蟲，先用0.5%次氯酸鈉溶液消毒2 min，再用無菌水沖洗，將雌蟲放置于含有900 μL發酵上清液的空穴中（2個/穴），25 ℃條件下進行孵化，5 d后統計孵化的線蟲總數，求出雌蟲孵化抑制率;處理2（CK）：用NA液體培養基作為對照，處理方式同處理1。

1. 2. 8 活性菌株發酵上清液對南方根結線蟲J2的殺線蟲活性 方法同1.2.3。

1. 2. 9 活性菌株發酵液對盆栽番茄南方根結線蟲的防控效果 試驗于2019年9—12月在湖南省植物保護研究所溫室內進行，試驗期間平均濕度70%左右，溫度28 ℃。供試番茄品種鉆紅一號（市售），以1.8%阿維菌素水乳劑為對照藥劑。采用灌根法處理。在育苗盤中，用經消毒處理的基質培育番茄，番茄長至4片真葉時，選擇長勢優良的番茄苗移植于經消毒處理的花盆中，恒溫恒濕溫室培養，定期澆水施肥，保持土壤肥力和濕度;移栽7 d供試番茄植株定根后，在番茄根基部接種線蟲，1000頭/株。接蟲第5～10 d后，分別用活性菌株發酵液50倍稀釋液（處理1）、1.8%阿維菌素水乳劑500倍稀釋液（處理2）和NA液體培養基（處理3，CK）灌根，每處理20株番茄苗，50 mL處理液/株，每處理重復3次;15 d后再灌根處理一次，方法同第1次。第2次處理后30 d進行調查，每處理調查10株番茄，參考成飛雪等（2011）的方法進行番茄根結線蟲危害分級，計算病情指數和防治效果;同時測定番茄植株的株高和根長，計算增長率、病情指數和防治效果。

1. 2. 10 活性菌株發酵液對大田黃瓜南方根結線蟲病的防治效果 試驗于2020年4—8月在湖南省長沙縣春華鎮蔬菜基地簡易大棚內進行，面積約120 m2，土壤為沙壤土，肥力中等，常年種植蔬菜，灌溉條件良好，歷年均有根結線蟲病發生，發病程度中等。供試黃瓜品種為鄂黃三號（根結線蟲感病品種，市售）。

試驗設5個處理，處理1～處理3：依次為5×109 CFU/mL活性菌株發酵液50、100和200倍稀釋液;處理4：1.8%阿維菌素乳油800倍液;處理5：清水對照（CK）。按500 mL處理液/穴灌蔸處理，每處理4次重復，每小區10 m2，22株黃瓜/小區，各處理按完全隨機區組排列，其他水肥管理按常規。于移栽前（4月25日）進行噴藥處理土壤，4月27日移植4葉黃瓜苗，5月2日和7日各灌根1次，共施藥3次。

根結線蟲J2數量、防治效果、黃瓜長勢及產量調查參考成飛雪等（2011）的方法，計算根結線蟲J2蟲口減退率、統計病情指數、防效及黃瓜產量和增長率。

1. 3 統計分析

試驗數據采用Excel 2013進行整理，運用SPSS 16.0進行統計及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2. 1 芽孢桿菌的分離及篩選結果

從抗線蟲黃瓜根際土壤樣品中共分離出93株菌株，通過篩選得到4株校正死亡率為85.00%以上的菌株，其中菌株C1發酵上清液對根結線蟲的校正死亡率約為95.96%，5次繼代培養后的殺線蟲活性仍在93.01%左右（圖1），表明菌株C1具有較強的抗根結蟲活性及穩定性。

2. 2 菌株C1鑒定

2. 2. 1 菌株形態鑒定 將菌株C1在NA培養基上劃線培養（圖2），其菌落直徑2～4 mm，圓形、偏淡黃色、光滑、不透明、表面平坦且有光澤、邊緣較整齊，細菌在電子顯微鏡下呈長桿（圖3）。

2. 2. 2 菌株生理生化測定 由表1可知，菌株C1的淀粉水解試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、硝酸鹽還原試驗、精氨酸雙水解酶試驗和菌膜形成試驗呈陰性反應，H2O2酶試驗呈陽性反應。

2. 2. 3 菌株16S rDNA序列測定及系統發育分析

測序結果菌株C1的16S rDNA序列長度為1455 bp，其NCBI登錄號為MK949359。將所得序列在NCBI數據庫進行比對，運用MEGA 7.0構建菌株C1序列與參比菌株序列的系統發育進化樹，結果（圖4）顯示，菌株C1與Lysinibacillus macroides（登錄號KX027335）處于同一個分支，存在一定的親緣關系，同源性在99.79%左右。綜合菌株C1形態、生理生化和分子鑒定結果，菌株C1鑒定為長形賴氨酸芽孢桿菌（L. macroides）。

2. 3 菌株C1發酵上清液對南方根結線蟲卵的抑制效果

由表2可知，以NA液體培養基為對照，南方根結線蟲卵5 d的孵化率達92.3%，但經過菌株C1發酵上清液原液和5倍、10倍稀釋液處理的卵孵化率為24.1%～33.5%，顯著抑制了南方根結線蟲卵的孵化（P<0.05，下同），相對抑制率可達64.72%～74.50%，說明菌株C1發酵上清液能有效抑制南方根結線蟲卵的孵化。

2. 4 菌株C1發酵上清液對南方根結線蟲雌蟲孵化的抑制效果

由表3可知，經過菌株C1發酵上清液處理后，南方根結線蟲雌蟲孵化的相對抑制率達95.17%，明顯抑制了南方根結線蟲雌蟲的孵化，顯示出良好的應用前景。

2. 5 菌株C1發酵上清液對南方根結線蟲J2的殺線蟲活性

菌株C1發酵上清液對南方根結線蟲J2的24和48 h校正死亡率分別為98.83%和100.00%，說明菌株C1發酵上清液對南方根結線蟲具有顯著的毒殺效果（表4）。

2. 6 菌株C1發酵液對盆栽番茄南方根結線蟲的防控效果

盆栽試驗發現，經菌株C1發酵液處理的番茄根結較少，根系相對發達，而對照根結成瘤（圖5）。

由表5可知，經菌株C1發酵液處理的病情指數明顯低于對照，防效達73.24%，且比阿維菌素對照處理的效果（防效為67.79%）更佳;菌株C1發酵液處理的番茄株高和根長較阿維菌素和對照處理均有明顯增加，分別比對照處理高58.30%和47.17%。

2. 7 菌株C1發酵液對大田黃瓜南方根結線蟲病的防治效果

由表6可知，相較于清水對照（CK），3種不同濃度的菌株C1發酵稀釋液處理均能降低黃瓜根圍土壤中根結線蟲J2的種群數量，尤其是50倍液處理30 d后的蟲口減退率達79.07%，與阿維菌素的防效（82.11%）無顯著差異（P>0.05，下同）。

從表7可看出，各濃度菌株C1發酵稀釋液處理對黃瓜根結線蟲病均有一定的防治效果，其中50倍稀釋液的防效可達82.67%，與對照藥劑阿維菌素處理的防效（86.22%）無顯著差異。施用菌劑后，于黃瓜幼苗期和坐果期測量黃瓜株高，結果顯示，3種不同濃度的菌株C1發酵稀釋液處理對黃瓜生長均有一定的促進作用，其中50倍稀釋液處理的效果最佳，其苗期和坐果期株高分別較CK高3.3和24.6 cm;同時，各處理黃瓜產量也顯著提升，尤其是50倍稀釋液處理的黃瓜小區產量較CK增產22.0%，顯著高于阿維菌素處理（增產率為11.3%）。表明菌株C1發酵液不僅對蔬菜根結線蟲病有良好的防治效果，且能促進蔬菜生長，提高作物產量，具有良好的應用前景。圖6為大田試驗各處理黃瓜植株和根部生長情況。

3 討論

植物根結線蟲危害作物種類廣、傳播途徑多樣，因其寄生于植物根內韌皮部，加之蟲體結構的特殊性，病原抗藥性很強，僅有少數幾種化學農藥對其具有較好的防治效果，但長期使用會提高線蟲的抗藥性，使防治用藥量日趨增大。本研究篩選的長形賴氨酸芽孢桿菌C1菌株對南方根結線蟲具有較高活性，離體對南方根結線蟲卵、雌蟲和J2均有較好的控制作用，大田對黃瓜根結線蟲病亦有較好的防治效果，且能促進蔬菜生長，提高作物產量，具有抗病促生作用。

對于植物根結線蟲的預防和防治，生物手段是目前的主要研究方向。植物根結線蟲生防資源是指其在自然界的所有天敵生物，包括真菌、細菌、放線菌、植物、病毒和捕食性線蟲等（祝明亮等，2004;郝昕等，2021），其中生防細菌是近年的研究熱點，越來越多的細菌被分離，不同的作用方式被報道。根據作用方式不同，又分為寄生細菌、內生細菌和根際細菌3大類。研究人員對根際生防菌進行了深入研究，包括資源篩選、活性物質分離鑒定及機理研究等。就生防資源而言，能有效防治植物寄生線蟲的根際芽孢桿菌種類很多。因芽孢桿菌在自然界各種生境中普遍存在，且環境適應性強，能自動產生多種可抑制線蟲活性的代謝物，同時可有效促進植物生長發育等（Abd-Elgawad and Askary，2018;Mhatre et al.，2019），而具有防治土傳病害的優勢，如解淀粉芽孢桿菌（朱麗梅等，2009）、巨大芽孢桿菌（梁建根等，2011）、蘇云金芽孢桿菌（成飛雪等，2011）、枯草芽孢桿菌（Khalil et al.，2012）、簡單芽胞桿菌（王進福等，2016）、阿氏芽孢桿菌（姚思敏，2018）、堅強芽孢桿菌（劉廣穎，2020）和蠟樣芽胞桿菌（趙勁捷等，2020）等多種芽孢桿菌被應用于根結線蟲防治，其中利用最成功的是蘇云金芽孢桿菌，為無公害生產中首推的生物殺蟲劑品種（Wei et al.，2003;徐重新等，2019）。賴氨酸芽孢桿菌與其他芽孢桿菌一樣廣泛存在于土壤、海洋、植物及動物體內，但相關應用限于生物表面活性劑（Seo et al.，2013）、重金屬污染治理和控制蚊媒疾病（Vargas and Dussán，2013）、胞外多糖生產（曾承露等，2017）、石油降解（李國麗等，2018）和抑制真菌（鄭雯等，2019）中，對于在線蟲病害防治方面的研究鮮有報道。

前期研究已證明根際促生菌對根結線蟲的控制效果，芽孢桿菌、假單胞菌的細菌懸液和濾液對爪哇根結線蟲（Siddiqui and Shaukat，2003）、南方根結線蟲（Radwan et al.，2012）和埃塞俄比亞根結線蟲（Aballay et al.，2013）幼蟲的防效均超過70%，對卵孵化也有類似的效果;同時，溫室條件下根際細菌對根際寄生蟲的防效為80%（Aballay et al.，2013）。但目前對根際細菌防治線蟲的拮抗機制研究還不夠透徹，大致分為以下幾個方面：（1）根際細菌可改變根際分泌物。Racke和Sikora（1992）研究發現，根際細菌致使植物根際分泌物發生改變，進而影響其寄生線蟲的發育。（2）根際細菌通過代謝產生如抗生素、次生代謝物、酶、NH3、NO2、H2S和小分子物質等影響線蟲的行為或殺死線蟲（郭榮君等，1996;Siddiqui and Shaukat，2003）。程萬里等（2020）從江西省湖口縣有機復合污染的毛茛根際土壤中分離得到多粘類芽胞桿菌KM2501-1產生的環二肽類物質cyclo （Pro-Phe）殺線蟲效率達84.75%。（3）根際細菌與線蟲的營養和空間位點競爭。Zuckerman和Kuhlman（2001）研究發現，主根表層的凝聚素與根結線蟲體表糖蛋白相互識別從而致使寄主植物受到侵染。（4）根際細菌誘導作物系統抗性。巨大芽孢桿菌Sneb 207能誘導大豆植株對大豆孢囊線蟲產生系統抗性，使葉綠素含量提高，光合速率增大，從而達到防治病害的目的（周園園，2016）。以上報道表明，根際細菌對線蟲的抑制活性是一種或幾種因子共同作用的結果。本研究認為，正是根際細菌對線蟲抑制作用機制呈多樣性的特點，使根際細菌成為當前線蟲生物防治中重要的天敵類群而受到研究者的關注。

本研究篩選獲得的長形賴氨酸芽孢桿菌C1，前期試驗表明其不僅對南方根結線蟲具有毒殺效果，同時對花生根結線蟲、爪哇根結線蟲、北方根結線蟲、擬禾本科根結線蟲和模式線蟲——秀麗小桿線蟲等也具有較高的活性（程菊娥，2020），說明該菌株對線蟲具有廣譜抗性。無論是離體測試的發酵上清液還是田間試驗發酵液，菌株C1對南方根結線蟲均具有明顯防效，說明該菌株的代謝產物具有殺線蟲活性，具有較高的研究價值。長形賴氨酸芽孢桿菌作為一類藥肥兩用的根際微生物在植物線蟲病害生物防治方面具有較大的開發潛力，其發酵液次級代謝產物的活性物質鑒定及其對線蟲的作用機制還有待進一步探究。

4 結論

篩選獲得的長形賴氨酸芽孢桿菌菌株C1不僅對南方根結線蟲病具有良好的防治效果，且具有促進作物生長的作用，可作為生物農藥和肥料在農業生產中開發利用。

參考文獻：

陳麗潔，蘇品，張卓，翟忠英，孔小婷，杜曉華，程菊娥，唐雯，張德詠，劉勇. 2019. 一株耐鹽類球紅細菌的分離鑒定及其對不同作物的促生作用[J]. 南方農業學報，50（5）：964-973. [Chen L J，Su P，Zhang Z，Zhai Z Y，Kong X T，Du X H，Cheng J E，Tang W，Zhang D Y，Liu Y. 2019. Isolation and identification of one salt-tolerant strain of Rhodobacter sphaeorides and its growth promoting effect on different crops[J]. Journal of Southern Agriculture，50（5）：964-973.] doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2019. 05.07.

成飛雪，王忠勇，劉勇，張德詠，程菊娥. 2011. 殺線蟲蘇云金芽胞桿菌菌株YC-10的分離鑒定及活性測定[J]. 中國生物防治學報，27（4）：540-546. [Cheng F X，Wang Z Y，Liu Y，Zhang D Y，Cheng J E. 2011. Identification and nematicidal activities of Bacillus thuringiensis strain YC-10[J]. Chinese Journal of Biological Control，27（4）：540-546.] doi：10.16409/j.cnki.2095-039x.2011.04.020.

程菊娥. 2020. 長形賴氨酸芽孢桿菌、微生物菌劑、生防藥劑及其制備方法和應用：202010728635.9[P]. 2020-10-13.[Cheng J E. 2020. Lysinibacillus macrolides，microbial agents，biocontrol agents and their preparation methods and applications：202010728635.9[P]. 2020-10-13.]

程菊娥，孔小婷. 2017. 湖南辣椒根結線蟲病生防資源研究概述[J]. 辣椒雜志，15（3）：1-7. [Cheng J E，Kong X T. 2017. Review of biological control species against hot pepper root-knot nematodes in Hunan[J]. Journal of China Capsicum，15（3）：1-7.] doi：10.16847/j.cnki.issn.1672-4542. 2017.03.001.

程萬里，陳珍，楊雪，黃典，張吉斌. 2020. 多粘類芽胞桿菌KM2501-1殺南方根結線蟲活性產物研究[J]. 微生物學報，60（8）：1629-1637. [Cheng W L，Chen Z，Yang X，Huang D，Zhang J B. 2020. Inhibition of Meloidogyne incognita by active compound from Panebacillus polymyxa KM2501-1[J]. Acta Microbiologica Sinica，60（8）：1629-1637.] doi：10.13343/j.cnki.wsxb.20190489.

丁磊. 2017. 生防細菌PFMP-5對根結線蟲的生防機制及其應用研究[D]. 晉中：山西農業大學. [Ding L. 2017. Apprisal and biocontrol mechanism of biocontrol bacteria PFMP-5 against root-knot nematodes[D]. Jinzhong：Shanxi Agriculture University.]

東秀珠，蔡妙英. 2001. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社：364-398. [Dong X Z，Cai M Y. 2001. Manual for systematic identification of common bacteria[M]. Beijing：Science Press：364-398.]

杜珊珊. 2018. 南方根結線蟲生防菌的篩選及其對植物系統抗性的影響[D]. 泰安：山東農業大學. [Du S S. 2018. Screening of biocontrol bateria agaist Meloidogyne incognita and the effects on plant system resistance[D]. Tai’an：Shandong Agriculture University.]

段玉璽. 2011. 植物線蟲學[M]. 北京：科學出版社. [Duan Y X. 2011. Plant nematology[M]. Beijing：Science Press.]

葛俊杰，王延紅，劉長仲. 2016. 南方根結線蟲初始接種量對番茄生長的影響及防治指標研究[J]. 甘肅農業大學學報，51（5）：57-61. [Ge J J，Wang Y H，Liu C Z. 2016. Effect of initial inoculation amount of meloidogyne incongnita on tomato growth and its control index research[J]. Journal of Gansu Agricultural University，51（5）：57-61.]

郭榮君，劉杏忠，楊懷文. 1996. 應用根際細菌防治植物寄生線蟲的研究[J]. 中國生物防治，12（3）：134-137. [Guo R J，Liu X Z，Yang H W. 1996. Study on the biocontrol of plant-parasitic new atodes by rhizobacteria[J]. Chines Jounal of Biological Control，12（3）：134-137.]

郝昕，王博文，陳潔，李洋，馬玲. 2021. 食線蟲真菌防治植物寄生線蟲研究進展[J]. 河南農業科學，50（1）：1-9. [Hao X，Wang B W，Chen J，Li Y，Ma L. 2021. Research progress of nematophagous fungi against plant parasitic nematodes[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，50（1）：1-9.] doi：10.15933/j.cnki.1004-3268.2021.01.001.

李國麗，曾小英，翟立翔，冷艷，劉夢圓，李師翁，陳拓. 2018. 一株石油降解菌Lysinibacillus fusiformis 23-1的篩選鑒定及原油降解特性[J]. 浙江農業學報，30（7）：1229-1236. [Li G L，Zeng X Y，Zhai L X，Leng Y，Liu M Y，Li S W，Chen T. 2018. Screening，identification and charac-teristics of Lysinibacillus fusiformis 23-1 for petroleum degradation[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis，30（7）：1229-1236.] doi：10.3969/j.issn.1004-1524.2018.07.17.

李培京. 2008. 掃描電鏡生物樣品制備與觀察[J]. 現代科學儀器，（3）：124-125. [Li P J. 2008. Preparation and observation of biological samples by SEM[J]. Modern Scientific Instruments，（3）：124-125.]

梁建根，鄭經武，郝中娜，王連平，陶榮祥，張昕. 2011. 生防菌K-8對南方根結線蟲的防治及其鑒定[J]. 中國農學通報，27（21）：282-286. [Liang J G，Zheng J W，Hao Z N，Wang L P，Tao R X，Zhang X. 2011. The identification of biocontrol bacterium k-8 and its biological control against Meloidogyne incognita[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin，27（21）：282-286.]

劉廣穎. 2020. 防治南方根結線蟲生防細菌及其活性揮發物的篩選、鑒定和初步應用[D]. 泰安：山東農業大學. [Liu G Y. 2020. Screening，identification and primary application of biocontrol bacteria and their volatile organic compounds against Meloidogyne incognita[D]. Tai’an：Shandong Agriculture University.]

劉維志. 1998. 植物病原線蟲學[M]. 北京：中國農業出版社. [Liu W Z. 1998. Plant pathogenic nematology[M]. Beijing：China Agricultural Press.]

路雪君，廖曉蘭，成飛雪，劉勇. 2010. 根結線蟲的生物防治研究進展[J]. 中國農業科技導報，12（4）：44-48. [Lu X J，Liao X L，Cheng F X，Liu Y. 2010. Research progressin biocontrol of meloidogyne[J]. Journal of Agricultural Science and Technology，12（4）：44-48.] doi：10.3969/j.issn. 1008-0864.2010.04.09.

呂達. 2017. 南方根結線蟲生防菌的篩選、鑒定以及防治效果研究[D]. 泰安：山東農業大學. [Lü D. 2017. Screening and identification of biocontrol bacteria and their effects on Meloidogyne incognita[D]. Tai’an：Shandong Agriculture University.]

舒然，李磊，龍友華，顧桂飛，張竹竹，尹顯慧. 2020. 獼猴桃根結線蟲形態觀察與病原鑒定[J]. 南方農業學報，51（12）：2971-2977. [Shu R，Li L，Long Y H，Gu G F，Zhang Z Z，Yin X H. 2020. Morphological observation and pathogen identification of kiwifruit root-knot nematodes[J]. Journal of Southern Agriculture，51（12）：2971-2977.] doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2020.12. 013.

孫海，馮鵬，王俊俠，李云龍，李錦，胡彬，王胤，曹金娟，鄭建秋. 2020. 20%辣根素水乳劑對南方根結線蟲的室內毒力[J]. 蔬菜，（12）：48-50. [Sun H，Feng P，Wang J X，Li Y L，Li J，Hu B，Wang Y，Cao J J，Zheng J Q. 2020. The indoor toxicity of 20% allyl isothiocyanate water emulsion to Meloidogyne incognita[J]. Vegetables，（12）：48-50.]

王進福，文才藝，劉偉成，董丹，裘季燕，劉霆. 2016. 根結線蟲生防細菌的篩選及鑒定[J]. 北方園藝，（9）：121-124. [Wang J F，Wen C Y，Liu W C，Dong D，Qiu J Y，Liu T. 2016. Screening and identification of bocontrol bacterial against root-knot nematode[J]. Northern Horticulture，（9）：121-124.] doi：10.11937/bfyy.201609032.

徐重新，劉敏，張霄，劉媛，張存政，劉賢金. 2019. 農藥危害風險及其殘留檢測用廣譜特異性抗體研究進展[J]. 江蘇農業學報，35（2）：489-496. [Xu C X，Liu M，Zhang X，Liu Y，Zhang C Z，Liu X J. 2019. Advances in the develop-ment of broad-specificity antibodies for pesticide residue determination[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Scien-ces，35（2）：489-496.] doi：10.3969/j.issn.1000-4440.2019. 02.033.

姚思敏. 2018. 具殺植物線蟲活性的芽孢桿菌篩選[D]. 長沙：湖南農業大學. [Yao S M. 2018. Screening Bacillus strains against plant-parasitic nematodes[D]. Changsha：Hunan Agriculture University.]

曾承露，李鋒，黃德娜. 2017. 紡錘形賴氨酸芽孢桿菌P-3產胞外多糖發酵工藝參數優化[J]. 中國釀造，36（6）：111-115. [Zeng C L，Li F，Huang D N. 2017. Optimization of fermentation technical parameters of Lysinibacillus fusiformis P-3 for exopolysaccharides production[J]. China Brewing，36（6）：111-115.] doi：10.11882/j.issn.0254-5071. 2017.06.023.

張立強，黃惠琴，崔瑩，鄒瀟瀟，劉敏，鮑時翔. 2014. 一株抗根結線蟲芽孢桿菌的分離篩選及鑒定[J]. 熱帶作物學報，35（9）：1825-1829. [Zhang L Q，Huang H Q，Cui Y，Zou X X，Liu M，Bao S X. 2014. Separation，screening and identification of Bacillus sp. antagonistic to root-knot nematodes[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，35（9）：1825-1829.] doi：10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.027.

張楠. 2017. 我國殺線蟲劑登記現狀及問題分析[J]. 農藥科學與管理，38（7）：23-30. [Zhang N. 2017. Status and ana-lysis of nematicides registered in China[J]. Pesticide Scien-ce and Administration，38（7）：23-30.] doi：10.3969/j.issn. 1002-5480.2017.07.004.

趙丹. 2018. 假單胞菌誘導番茄抗根結線蟲的機理研究[D]. 沈陽：沈陽農業大學. [Zhao D. 2018. Mechanism of Pseudomonas induced tomato resistance to root knot nematode[D]. Shenyang：Shenyang Agriculture University.]

趙惠. 2018. 殺線蟲活性生防細菌篩選鑒定及脂肽的初步分離[D]. 沈陽：沈陽農業大學. [Zhao H. 2018. Screening and identification of nematicidal bacteria and preliminary separation of lipopeptide[D].Shenyang：Shenyang Agriculture University.]

趙勁捷，王帥，范海燕，趙迪，劉曉宇，朱曉峰，王媛媛，段玉璽，陳立杰. 2020. 防治南方根結線蟲的根瘤內生細菌的篩選及鑒定[J]. 中國生物防治學報，36（5）：811-820. [Zhao J J，Wang S，Fan H Y，Zhao D，Liu X Y，Zhu X F，Wang Y Y，Duan Y X，Chen L J. 2020. Screening and identification of endophytic bacteria isolated from root nodules for control of Meloidogyne incognita[J]. Chinese Journal of Biological Control，36（5）：811-820.] doi：10.16409/j.cnki.2095-039x.2020.05.023.

鄭雯，楊興變，康冀川，李洪慶. 2019. 賴氨酸芽孢桿菌He14發酵產物抗真菌活性的初步研究[J]. 食品與發酵工業，45（18）：22-26. [Zheng W，Yang X B，Kang J C，Li H Q. 2019. Antifungal activity of fermentation broth of Lysinibacillus fusiformis He14[J]. Food and Fermentation Industries，45（18）：22-26.] doi：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.020905.

周園園. 2016. 巨大芽孢桿菌Sneb207誘導大豆抗胞囊線蟲機理研究[D]. 沈陽：沈陽農業大學. [Zhou Y Y.? 2016.? Biocontrol control mechanism of Bacillus megaterium Sneb207 against soybean cyst nematode[D]. Shenyang：Shenyang Agriculture University.]

朱麗梅，吳小芹，陳江天，徐旭凌. 2009. 一株毒殺松材線蟲的解淀粉芽孢桿菌活性物質的基本性質[J]. 中國生物防治，25（4）：359-363. [Zhu L M，Wu X Q，Chen J T，Xu X L. 2009. Elementary properties of the nematicidal crude toxin produced by Bacillus amyloliquefaciens JK-JS3[J]. Chinese Journal of Biological Control，25（4）：359-363.] doi：10.16409/j.cnki.2095-039x.2009.04.018.

祝明亮，李天飛，張克勤，夏振遠. 2004. 根結線蟲生防資源概況及進展[J]. 微生物學通報，31（1）：100-104. [Zhu M L，Li T F，Zhang K Q，Xia Z Y. 2004. Overview and progress of resources for biological control of root-knot nematodes[J]. Microbiology China，31（1）：100-104.] doi： 10.13344/j.microbiol.china.2004.01.024.

Aballay E，Ordenes P，M?rtensson A，Persson P. 2013. Effect of rhizobacteria on parasitism by Meloidogyne ethiopica on grapevines[J]. European Journal of Plant Pathology，135：137-145. doi： 10.1007/s10658-012-0073-7.

Abd-Elgawad M M M，Askary T H. 2018. Fungal and bacterial nematicides in integrated nematode management strategies[J]. Egyptian Journal of Biological Pest Control，28（1）：74. doi： 10.1186/s41938-018-0080-x.

Giannakou I O，Karpouzas D G，Anastasiades I，Tsiropoulos N G ，Georgiadou A. 2005. Factors affecting the efficacy of non-fumigant nematicides for controlling root-knot nematodes[J]. Pest Management Science，61（10）：961-972.? doi：10.1002/ps.1081.

Gogoi B B，Sarodee B. 2019. Bio-management of root knot nematode in long pipper[J]. Annals of Plant Protection Sciences，27（1）：159-160. doi： 10.5958/0974-0163.2019. 00031.4.

Jones J T，Haegeman A，Danchin E G J，Gaur H S，Helder J，Jones M G K，Kikuchi T，Manzanilla-López R，Palomares-Rius J，Weseael W M L，Perry R N. 2013. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology[J]. Molecular Plant Pathology，14（9）：946-961. doi： 10.1111/ mpp.12057.

Khalil M S E H，Allam A F G，Barakat A S T. 2012. Nematicidal activity of some biopesticide agents and microorganisms against root-knot nematode on tomato plants under greenhouse conditions[J]. Journal of Plant Protection Research，52（1）：47-52. doi：10.2478/v10045-012-0008-5.

Li J，Zou C G，Xu J P，Ji X L，Niu? M，Yang J K，Huang X W，Zhang K Q. 2015. Molecular mechanisms of nematode-nematophagous microbe interactions：Basis for biological control of plant-parasitic nematodes[J]. Annual Review of Phytopathology，53（1）：67-95. doi：10.1146/annurev-phyto-080614-120336.

Mahgoob A，El-Tayeb T. 2010. Biological control of the root-knot nematode，Meloidogyne incognita on tomato using plant growth promoting bateria[J]. Egyptian Journal of Biological Pest Control，20（2）：95-103.

Mhatre P H，Karthik C，Kadirvelu K，Divya K L，Venkatasalam E P，Srinivasan S，Ramkumar G，Saranya C，Shanmuganathan R. 2019. Plant growth promoting rhizobacteria（PGPR）：A potential alternative tool for nematodes bio-control[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnolog，17：119-128. doi： 10.1016/j.bcab.2018.11.009.

Radwan M A，Farrag S A A，Abu-Elamayem M M，Ahmed N S. 2012. Biological control of the root-knot nematode，Meloidogyne incognita on tomato using bioproducts of microbial origin[J]. Applied Soil Ecology，56：58-62. doi：10.1016/j.apsoil.2012.02.008.

Racke J，Sikora R A. 1992. Isolation，formulation and antagonistic activity of rhizobacteria toward the potato cyst nematode Globodera pallida[J]. Soil Biology and Biochemistry，24（6）：521-526. doi：10.1016/0038-0717（92）90075-9.

Seo M H，Kim K R，Oh D K. 2013. Production of a novel compound，10，12-dihydr-oxystearic acid from ricinoleic acid by an oleate hydratase from Lysinibacillus fusiformis[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，97（20）：8987-8995. doi： 10.1007/s00253-013-4728-x.

Siddiqui I A，Shaukat S S. 2003. Suppression of root-knot disea-se by Pseudomonas fluorescens CHA0 in tomato：Importance of bacterial secondary metabolite，2，4-diacetyl-pholoroglucinol[J]. Soil Biology and Biochemistry，35：1615-1623. doi： 10.1016/j.soilbio.2003.08.006.

Siddiqui Z A，Mahmood I. 1999. Role of bacteria in the mana-gement of plant parasitic nematodes：A review[J]. Bioresource Technology，69（2）：167-179. doi：10.1016/S0960- 8524（98）00122-9.

Vargas J E，Dussán J. 2016. Adsorption of toxic metals and control of mosquitos-borne disease by Lysinibacillus sphaericus：Dual benefits for health and environment[J]. Biomedical and Environmental Sciences，29（3）：187-196. doi： 10.3967/bes2016.023.

Wei J Z，Hale K，Carta L，Platzer E，Wrong C，Fang S C，Ra-ffi V A. 2003. Bacillus thuringiensis crystal proteins that target nematodes[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，100（5）：2760-2765. doi：10.1073/pnas.0538072100.

Zuckerman M，Kuhlman D M. 2001. Personality and risk-taking：Common bisocial factors[J]. Journal of Personality，68（6）：999-1029.

（責任編輯 麻小燕）