體外電轉染TGF-β1質粒對背根神經節軸突生長的影響①

胡譯文，張 衡，王銳英，沈 翀，劉瑞端，張 衡，王銳英，沈 翀，劉瑞端

(桂林醫學院附屬醫院骨科，廣西 桂林 541001)

周圍神經損傷是生活和工作中的常見事件，周圍神經在受到機械外力及各種理化因素損傷后，其神經元胞體、軸突、髓鞘等均會發生一系列的變性反應。病理表現為胞體腫大，尼氏體溶解或消失。修復周圍神經損傷的關鍵是神經元胞體的存活及軸突的延伸[1]。近年來運用轉基因技術治療周圍神經損傷已成為研究熱點[2]。轉化生長因子β1(transforming growth factor beta1，TGF-β1)是一種相對分子質量為 25 000 的活性多肽，屬于轉化生長因子TGF-β(transforming growth factor beta)多肽家族，具有拮抗腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha，TNF-a)的效應，抑制細胞內鈣離子濃度變化，拮抗興奮性氨基酸的神經毒性作用。周圍神經擠壓損傷，TGF-β1含量上升[3-4]。質粒是小型環狀DNA分子，是基因工程最常用、最簡單的載體。筆者應用電轉染方法將構建的TGF-β1質粒轉染入背根神經節細胞中[5]，培養背根神經節細胞，然后，觀察TGF-β1對背根神經節細胞軸突生長的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

8～10周齡C57BL/6健康雄性小白鼠6只，體重25～35 g，來源于桂林醫學院實驗動物中心。小鼠的飼養與實驗均在桂林醫學院實驗動物中心完成，環境溫度控制在20～23 ℃，濕度控制在40%～50%，室內光照時間為10∶00 am至22∶00 pm，黑暗時間為22∶00 pm至10∶00 am。動物飼料及飲用水均按照嚴格規范進行處理，小鼠飲用水pH值為3.0～3.5，按需、定期更換籠具及飲水瓶。

1.2 主要實驗儀器和試劑

倒置熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss)；NucleofectorRII 細胞核轉染儀，Amaxa電轉液(德國Lonza)；TGF-β1質粒(美國Clontech)；pBR322質粒(美國Thermo Scientific)；胰酶，Ⅱ型膠原酶(Gibco公司)；MEM培養基，胎牛血清，兔抗小鼠TGF-β1單克隆抗體，β-actin單克隆抗體，紅色熒光二抗免疫組織化學試劑(美國cell singling)；兔抗小鼠Tuj1單克隆抗體(美國Covance)。

1.3 背根神經節細胞的分離、培養與分析

分離小鼠DRG 內的背根神經節細胞進行原代培養；培養成功后，進行背根神經節細胞電轉染，設對照組和TGF-β1組。具體方法如下：C57BL/6小白鼠脫頸處死后，嚴格遵守無菌操作，用小組織剪沿小鼠背部皮膚正中線依次剪開皮膚，剝離皮下組織和脊椎旁肌肉，取出小鼠脊柱兩側背根神經節置于MEM無血清培養基中；吸除培養基，于37 ℃ 1 mlⅡ膠原酶中消化90 min，700 r離心 8 min后移除Ⅱ膠原酶，加入500 μl胰酶，37 ℃下消化15～20 min；700 r離心8 min，洗滌3次后，進行轉染。對照組中加入100 μl Amaxa電轉液(含濃度為4 μg/ml的 pBR322空白質粒10 μl與90 μl Amaxa電轉液)重懸細胞團； TGF-β1組加入100 μl電轉混合液(濃度為4 μg/ml的TGF-β1質粒10 μl與90 μl Amaxa電轉液)重懸細胞團；細胞懸液轉移至電轉杯，置入NucleofectorRII 細胞核轉染儀，選擇G13程序進行質粒電轉染[6]；電轉染后，加入含10%胎牛血清(FBS)的MEN培養基，將細胞濃度調整至1×105個/ml，加入至有無菌蓋玻片(多聚賴氨酸及層粘連蛋白浸泡過)的24孔培養板中，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養，3 d后用無菌PBS洗滌細胞，然后，進行Tuj1免疫組化染色：每孔加入200 μl 4%多聚甲醛PFA固定細胞，PBS液洗3次， 5 min/次；0.5% TritonX-100 孵育20 min，PBS洗3次， 2 min/次；3% H2O2室溫孵育5～10 min，每孔加入500 μl封閉液(1%胎牛血清，0.1% Triton X-100，2%山羊血清混合配制而成)于室溫下封閉60 min；吸除封閉液，PBS洗3次， 5 min/次；每孔的蓋玻片上滴加30 μl兔抗小鼠Tuj1單克隆抗體(1∶1 200)孵育1 h；PBS沖洗3次，滴加30 μl紅色熒光二抗孵育1 h，PBS洗3次后，取出蓋玻片，用MOUNT液封閉；置于倒置熒光顯微鏡下觀察神經細胞軸突生長情況并拍照。每組取100個DRG細胞，采用Axio-Vision4.6 software軟件分析神經細胞軸突長度。

1.4 Western-blot檢測TGF-β1

細胞培養3 d后，收集對照組和TGF-β1質粒電轉染組的背根神經節細胞，加入RIPA buffer 100 μl細胞裂解液，細胞裂解后以13 500 r離心10 min，提取總蛋白，100 ℃變性10 min；取20 μl總蛋白樣品置10% SDS-PAGE膠中電泳分離，然后將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜；5% 脫脂奶粉常規封閉 1 h，加入兔抗小鼠TGF-β1單克隆抗體(1∶1 000)，4 ℃過夜，室溫下加入二抗(羊抗兔IgG，1∶10 000)孵育1 h，ECL 顯色。β-actin單克隆抗體(1∶25 000 稀釋液)為內參照。應用Image-J圖像分析軟件分析數據，實驗重復 3 次。

1.5 統計學分析

2 結果

2.1 背根神經節細胞形態

背根神經節細胞培養4 h后開始貼壁，1 d后在顯微鏡下觀察可見胞體周圍開始有軸突長出，3 d后形態更為典型，細胞胞體呈圓形，胞體發出兩條線狀軸突，軸突上有少量分叉。

2.2 背根神經節細胞軸突長度

背根神經節細胞培養3 d后，免疫熒光染色，Axio-Vision4.6 software軟件分析背根神經節細胞軸突長度，TGF-β1組為(5.231±1.03)mm， 對照組為(3.342±0.72)mm，TGF-β1組背根神經節細胞軸突明顯長于對照組， 差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 顯微鏡下觀察Tuj1染色后的背根神經節細胞(100×)

2.2 TGF-β1蛋白表達

TGF-β1組TGF-β1蛋白條帶灰度掃描值(1.09±0.01)大于對照組(0.46±0.02)，差異有統計學意義(P<0.05)，TGF-β1組TGF-β1蛋白表達量高于對照組，見圖2。

圖2 Western-blot檢測 TGF-β1蛋白表達

3 討論

周圍神經損傷呈逐年升高趨勢，它可引起嚴重神經功能障礙[7]。周圍神經損傷會造成一段或整段神經纖維的變性或壞死，同時不可避免地損傷相應的神經元細胞，引起胞體病理性變化[8]。由于周圍神經纖維的可再生性，利用轉基因技術增強神經纖維再生能力，抑制神經元細胞胞體腫大及尼氏體溶解，促進軸突再生，修復周圍神經損傷[9]。神經軸突的再生需要神經元胞體的基因調節和位于軸突生長錐處的軸突組織合成，因此，近年來運用轉基因技術治療周圍神經損傷已經成為研究熱點。

TGF-β是有多種功能的蛋白多肽大家族，目前已發現轉化生長因子β1-5種分子。轉化生長因子β廣泛存在于動物的正常組織和轉化細胞中，以骨組織和血小板中含量最高，在骨組織中又以TGF-βl含量最高。TGF-βl由兩條肽鏈組成，每條肽鏈上有112個氨基酸，相對分子質量為25 000，TGF-βl有耐酸、堿，熱和耐變性等特性[10]。神經系統的TGF-β1則存在于腦脊膜、脈絡膜叢及外周神經與神經節中，有研究發現，TGF-β1可降低細胞內Ca2+濃度，抗細胞凋亡，拮抗興奮性氨基酸的神經毒性，且具有維持神經的結構穩定性，保護運動和感覺神經元免受損傷[11]。Caruso等[12]研究發現，TGF-β1表達缺失導致患者腦部組織炎性損傷加重。Jiang等[13]用 TGF-β1孵育神經細胞24 h，一氧化氮導致的神經毒性明顯降低。近年來，電轉染DRG細胞方法已廣泛應用于周圍神經軸突再生[14]，體外電轉染有明顯的優勢：轉染所需時間短，瞬時基因轉染有更高的轉染效率，更適用于對DRG神經元及軸突生長的生物學分析。本實驗應用成熟的體外電轉染方法將重組TGF-β1質粒轉染入背根神經節細胞，實驗結果表明，TGF-β1具有促進背根神經節細胞軸突生長，修復周圍神經的損傷，但TGF-β1促軸突生長的分子機制還不清楚，還待進一步研究與探索[15]。