半夏SSR分子標記開發與遺傳多樣性

張景，李曉東，宗慶波，何貝貝，拉基，景納良，王柯月，鐘淑梅，舒少華

1.華中農業大學植物科學技術學院，武漢 430070; 2.湖北省果茶辦公室，武漢 430070;3.九州通醫藥集團九信中藥研究院，武漢 430051

半夏(Pinelliaternata(Thunb.) Breit.)是天南星科多年生草本植物，其藥用部位為干燥塊莖，具有燥濕化痰、消痞散結的功效[1]，現代藥理研究發現半夏具有鎮咳、止嘔、抗炎抗病毒等作用[2]。半夏作為藥材使用歷史悠久，以野生資源為主，主要分布于四川、湖北、安徽、江蘇、河南和浙江等地。近年來，由于半夏生長環境的不斷惡化、人為過度采集，使半夏野生資源急劇減少[3]，因此，有必要開展半夏資源的保護和種質資源遺傳多樣性的研究[4]。同時，半夏分布廣泛，種質資源比較豐富，藥用品質也存在不同[5]，并且難以從形態上識別。目前生產中，發現極少數塊莖為紅色的半夏品種具有高產、高抗性等特點，但是卻沒有一套完整的選育方法。

SSR(simple sequence repeats，SSR)標記因其多態性高、重復性好、覆蓋面廣等優點，廣泛運用于QTL圖譜繪制、遺傳多樣性分析和分子標記輔助育種等方面[6-7]。Bernadette等[8]利用SSR分子標記構建了四倍體苜蓿的遺傳圖譜；李磊等[9]從50對ISSR引物中篩選到5對多態性高的引物，從而實現在分子水平對5種葉型半夏的鑒定與區分；徐敏等[10]通過開發9對SSR引物發現五味子居群間有一定的基因流，居群內存在著豐富的遺傳多樣性；Feng等[11]研究結果表明，SSR標記具有很高的重復性和信息量，可用于評價藥用菊科植物的遺傳多樣性和親緣關系。

目前對半夏的栽培[12]、藥理作用[13-14]等方面已有一些研究，但關于半夏種質資源遺傳多樣性和分子標記輔助育種等方面的研究相對較少。由于采用高通量測序方法開發SSR標記在植物中被廣泛應用[15-17]，本研究基于半夏轉錄組數據，設計開發SSR引物，對不同居群半夏之間的種群結構、遺傳多樣性進行分析，旨在為半夏資源保護、遺傳多樣性研究和分子輔助育種提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

半夏材料共17份，包括從全國收集的14份材料以及從湖北省江漢平原地區野生半夏資源中選育的3份材料，所有收集到的材料經湖北中醫藥大學陳科力教授鑒定為天南星科植物半夏(P.ternata)，收集到的材料種植于華中農業大學藥用植物資源圃。詳見表1。

表1 半夏試驗材料 Table 1 P. ternata germplasm

1.2 DNA提取

選取幼嫩的半夏葉片置于液氮中速凍帶回，采用改良的 CTAB法進行半夏基因組DNA的提取，利用超微量紫外分光光度計檢測DNA濃度與質量，于-20 ℃保存備用。

1.3 SSR引物開發

半夏轉錄組數據由云南農業大學楊生超教授提供。針對不同的Unigene設計SSR引物共2 000對。利用生物信息學軟件(Primer-blast)對引物進行比對，篩選出266對引物并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 多態性SSR引物篩選

利用2個不同居群半夏的葉片DNA(HTX1、HBLK)進行PCR擴增，通過2%瓊脂糖凝膠電泳篩選能夠擴增出目的產物大小且條帶清晰明亮的引物。利用初篩的引物分別對17份不同居群的半夏DNA進行PCR擴增，利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測初篩引物的多態性。

1.5 PCR擴增

采用20 μL體系：PCR Buffer 2 μL,dNTP0.6 μL,Mg2+1.2 μL,Primer F 0.6 μL,Primer R 0.6 μL,TaqDNA聚合酶0.2 μL,模板DNA 2.0 μL,ddH2O 12.8 μL。

PCR反應程序： 94 ℃預熱5 min；94 ℃變性45 s，退火45 s，72 ℃模板延伸45 s， 35個循環，72 ℃延伸10 min。利用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測擴增產物，在120 V電壓下電泳90 min，硝酸銀染色，顯色液及蒸餾水洗凈，觀察并統計條帶，拍照保存圖像。

1.6 數據統計與分析

統計17份半夏樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果，在同一遷移位置上有條帶的記作“1”,無條帶的記作“0”，利用Excel表格建立1/0矩陣，利用PowerMarkerV3.25軟件計算引物多態信息含量(polymorpism index contet，PIC)、多態性頻率(frequency of polymorphism，FP)、等位基因數(allele number，AN)。利用POPGENE Version1.32、GenAIEX6.502軟件對不同居群半夏的遺傳多樣性參數進行計算，包括Shannon信息指數(I)、有效等位基因數(effective allele number,Ne)、居群間基因流(interpopulation gene flow,Nm)、居群間遺傳分化系數(coefficient of genetic differentiation between populations,Gst)。利用NTsys2.10軟件中的UPGMA(非加權算術平均值聚類法)進行聚類分析，繪制親緣關系樹狀圖。

2 結果與分析

2.1 多態性SSR引物篩選

本試驗從轉錄組數據中篩選得到266對引物，經PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選出75對能成功擴增出目的片段大小且條帶清晰明亮的引物。利用篩選得到的75對引物對17份半夏材料的DNA樣品進行PCR擴增，產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，對結果進行多態性分析，篩選出19對多態性好的引物(表2)，部分引物的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖見圖1。

M為600 bp marker；A、B分別為引物Unigene23904和Unigene49309擴增產物凝膠電泳圖；編號1～17為17個半夏居群DNA。M is 600 bp marker; A and B were primers Unigene23904 and Unigene49309 amplification products gel electrophoresis map,respectively.17 Pinellia ternata strains DNA were numbered 1-17.

表2 19對SSR引物信息 Table 2 The information of 19 pairs of SSR primers

2.2 半夏遺傳多樣性分析

利用篩選出的19對多態性高的引物，進行遺傳系數分析，由表3可知，19對SSR引物在17份半夏材料中共檢測到多態性位點49個，平均每對引物有2.5個多態性位點；等位基因數(Ne)一共有76個，平均值為3.8；Nei基因多樣性指數(He)范圍為0.606～1.762，PIC范圍為0.40～0.96，平均為0.60。多態性頻率FP的變幅為0.44～0.85，平均值為0.64。結果表明篩選出的引物多態性高，所選半夏材料遺傳多樣性豐富。

表3 半夏居群遺傳多樣性 Table 3 Genetic diversity of P. ternata populations

根據遺傳相似系數聚類分析結果將對應的SSR分子標記的帶型結果導入GenAIEX6.502軟件中，由分子方差分析(AMOVA)可知，88%的變異來源于個體間，12%的變異來源于群體間(P<0.001)(表4)，這說明群體與群體間的差異相對較小，但群體內的遺傳多樣性水平較高，而遺傳變異主要來源于個體間[18]。

表4 半夏居群分子方差分析 Table 4 Analysis of molecular variance(AMOVA) in P. ternata populations

另外居群間平均分化系數Gst為0.124，小于0.15(Wright)，說明居群間遺傳分化較小。總的基因流估算值Nm為1.765，大于1(Wright)，表明居群間能正常地進行基因交流，且居群間遺傳分化受基因流的影響較大。

2.3 半夏群體聚類分析

將19對多態性高的引物的讀帶結果按0/1矩陣格式在Excel中排版，通過NTSYSpc 2.10軟件中的Similarity計算遺傳相似度。相似度結果(表5)表明，不同居群半夏的遺傳相似度有差異，其中HNJS(湖南吉首)與HNSX(河南嵩縣)的遺傳相似度最高，為0.906。以遺傳相似系數為標準，利用UPGMA法構建聚類圖。由圖2可知，17個半夏居群間遺傳相似度為0.63～0.91，以遺傳相似系數0.70為標準，將17個居群分成5個類群，其中1個類群較大，其他4個類群較小。各類群內又可做亞類群分類，從下至上分類情況如下：

圖2 半夏遺傳相似度聚類圖Fig.2 Genetic similarity clustering map of P. ternata populations

表5 不同居群半夏遺傳相似度 Table 5 Genetic similarity of different P. ternata populations

第1類為云南文山和湖北荊州，第2類和第3類分別為重慶萬州和HTX1(選育材料)，第4類為江蘇鹽城和江西(JXJX)，第5類為湖北(HBWS)、HTX2(選育材料)、湖南常德、河南嵩縣、湖南吉首、湖北荊州、安徽宿松、貴州凱里、湖北(HBLK)、HTX3(選育材料)、湖北天門聚成一大類。聚類分析結果表明，不同居群的半夏遺傳結構不嚴格按照產地劃分，表明不同居群半夏有較大的基因交流程度，具有較近的親緣關系。

3 討 論

本研究基于轉錄組數據，設計開發SSR引物，利用多態性SSR引物進行半夏遺傳多樣性分析，結果表明：所開發的19對SSR引物多態性高，能將17份半夏材料明確區分。通過分子方差分析(AMOVA)發現半夏的遺傳變異主要來源于居群內。由遺傳多樣性分析可知，不同產地的半夏具有豐富的遺傳多樣性；由遺傳距離與聚類結果可知，不同居群的半夏遺傳結構非嚴格按照產地劃分。

3.1 SSR引物多態性

Botstein等[19]認為PIC<0.25、0.250.50分別表示引物多態性為較低、中等、較高。本試驗共篩選了76對SSR引物，其中篩選的19對引物的PIC范圍為0.40～0.96，平均為0.60，高于Du等[20]、陸歡等[21]的研究結果，說明本試驗所篩選的SSR引物多態性高。同時19對引物的Ne、PIC、FP均大于平均值，說明這19對引物整體的均一性較好，在一定程度上反映出這19對引物多態性比較豐富，對17份材料的區分能力較好，為下一步的遺傳多樣性分析提供了依據。

3.2 半夏遺傳多樣性

利用19對多態性較高的SSR引物對17個半夏居群進行遺傳多樣性分析，結果顯示每對引物的多態性位點平均為2.4個,多態性位點百分數平均為92.2%,等位基因數的平均值為3.8個,Nei基因多樣性指數平均為1.03，表明本研究收集的17份半夏材料蘊含了比較豐富的遺傳變化信息，顯示了較高水平的基因多樣性。而張君毅[22]采用SRAP分子標記方法對24個居群半夏進行遺傳多樣性分析，從中篩選出29對引物，共檢測到286個位點，多態性位點百分數占48.3%；Nei’s基因多樣性指數平均值為0.198，同樣也證明了半夏居群存在豐富的遺傳多樣性。

研究遺傳多樣性有助于分析生物多樣性的起源和進化，并為植物分類提供有益的資料，進而為植物育種和保護策略制定基礎[23]，因此，遺傳育種的前提是做好天然居群及居群間遺傳多樣性和遺傳變異的研究。鄭丹書[24]對半夏居群間、居群內的分化程度進行分析，結果表明半夏居群內部存在較大變異，占67.18%；而居群間的變異程度較小，為32.82%;由POPGENE3.2計算得出Gst=0.411 2，Nm=0.715 9，結果也闡明了半夏居群大部分的變異(58.88%)存在于居群內部，而導致居群存在較高分化水平的主要原因可能是基因流。本研究發現半夏居群間分化系數Fst為0.124，說明居群間遺傳分化較小。而通過分子方差分析(AMOVA)發現居群內的變異達到88%，也驗證了半夏的遺傳變異主要來源于居群內。而Nm值為1.765，表明居群間能正常地進行基因交流，且居群間遺傳分化受基因流的影響較大。由遺傳多樣性分析可知，不同居群的半夏具有豐富的遺傳多樣性；根據聚類結果分析可知，不同居群的半夏遺傳結構不嚴格按照產地劃分，表明不同居群半夏有較大的基因交流程度，具有較近的親緣關系，造成這種現象的原因可能是：①由于栽培材料在長期的馴化過程中出現了遺傳分化以及部分材料的來源混亂導致的[25]；②也可能是因為人為的半夏引種栽培干擾較大，加之多地區品種遺傳背景高度復雜，而半夏常以無性繁殖為主，且世代交替頻繁，從而導致種質一致性差[26]。