天冬氨酸轉氨酶在中慢生根瘤菌MAFF303099共生固氮中的作用

王婧儀，曹揚榮，朱輝

農業微生物學國家重點實驗室/華中農業大學生命科學技術學院，武漢 430070

自發現土壤微生物與豆科植物共生具有固定氮元素的功能[1-2]以來，兩者形成的共生體系一直是人類研究的熱點領域。在共生固氮過程中，根瘤菌在根瘤中定殖并分化形成具有固氮能力的類菌體[3]，與宿主植物發生復雜的物質交換和信號轉導。建立的共生固氮網絡需要整合植物宿主與類菌體兩者的碳-氮代謝途徑。

類菌體為適應根瘤環境會抑制和激活不同的代謝途徑，與此同時，植物根瘤中的代謝也會發生一些特化。盡管我們已經了解兩者之間會發生碳氮交換，但至今對于其具體機制并不清楚。在豆科植物與根瘤菌形成的共生體中，細菌向植物提供氮素營養，以換取宿主供應的碳源與能源[4]。相對于植物的根系，根瘤組織中存在高豐度的蔗糖[5]。植物通過光合作用產生的蔗糖經韌皮層輸送給根瘤，在侵染細胞的細胞質中蔗糖合成酶和糖酵解酶等的作用下經過一系列分解代謝，轉化為蘋果酸和琥珀酸等四碳二羧酸類物質[6]?，F在普遍認為這2種有機酸是植物提供給類菌體的主要能源和碳源[7-8]。類菌體膜上存在四碳二羧酸轉運系統Dct (energy-dependent dicarboxylate transport)可以轉運四碳二羧酸類物質進入類菌體[9]，其后可能通過三羧酸循環驅動類菌體的呼吸[10]。類菌體中天冬氨酸轉氨酶催化三羧酸循環中的草酰乙酸與谷氨酸反應生成天冬氨酸與α-酮戊二酸，參與對植物碳源的利用與代謝。在苜蓿根瘤菌中可轉運天冬氨酸至共生體腔的Aap/Bra轉運蛋白是保證固氮能夠進行所必需[11]。除此之外天冬氨酸轉氨酶的缺失也會導致苜蓿根瘤菌的結瘤不固氮表型[12]。

2004年日本學者檢測了中慢生根瘤菌MAFF303099(MesorhizobiumjaponicumMAFF303099)與百脈根共生固氮過程中基因表達變化情況，其中上調表達的基因多位于染色體共生島位置[13]。推測這些上調表達基因很可能與共生固氮網絡的維持相關。本研究利用相關轉錄調控數據庫，通過比較分析，選取部分上調表達基因，通過同源重組的方式進行敲除，考察該基因敲除后對根瘤菌與百脈根共生固氮過程的影響。這些基因涉及蛋白分泌、物質轉運、代謝等生理生化活動，以期通過這種方法篩選出參與共生固氮調控的新基因，進一步解析根瘤菌-豆科植物的共生固氮機制。

1 材料與方法

1.1 材料及載體

百脈根中慢生根瘤菌MAFF303099(MesorhizobiumjaponicumMAFF303099)、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、大腸桿菌S17-1、大腸桿菌BL21(DE3)-Codon Plus 及質粒pBBRMCS-3、pGEX-4T-1和pK18-mob-SacB-Genta均由華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室生物固氮室研究保藏；百脈根(Lotusjaponicus)MG-20生態型種子由華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室生物固氮研究室擴繁。本研究中的引物合成和基因測序主要由上海生工生物工程有限公司、武漢擎科生物技術有限公司、北京奧科生物技術有限等公司完成；文中所用到的限制性內切酶、T4 DNA連接酶、ExTaq酶、Primer star DNA合成酶等均購自寶生物公司。根瘤菌基因組抽提試劑盒為全式金公司產品，谷草轉氨酶(GOT)活性檢測試劑盒為北京索寶萊公司產品。其他生化試劑均為國產分析純產品。

1.2 百脈根盆栽試驗

百脈根種子萌發時，先用磨砂紙輕輕刮磨約1 min，將磨好的種子倒入無菌錐形瓶，用濃硫酸處理5～8 min，后將濃硫酸吸出，用無菌水沖洗種子5次，去除殘留的濃硫酸。2%的次氯酸鈉溶液處理8～10 min，后用無菌水清洗種子8～10次,去除殘余的次氯酸鈉。加入少許無菌水淹沒種子表面， 4 ℃條件避光進行春化。后將已經膨脹體積變大的種子置于無糖MS培養基上，22 ℃暗培養2 d使其生根，光照培養(培養條件：16 h光培養/8 h暗培養)2～3 d發芽。之后轉移到無菌培養基質(蛭石和珍珠巖的質量比為3∶1)中。移栽完畢后，置于23 ℃的光照培養箱中培養，光照條件為16 h光照/8 h黑暗。百脈根幼苗長出第1片真葉后,接種活化后的新鮮根瘤菌懸液(D600=0.02～0.05)5 mL/棵至百脈根根部。

1.3 固氮酶活性的測定

取帶根瘤的百脈根植株放入小玻璃瓶中，瓶口密封。先用注射器從瓶中抽出1/10體積的空氣，造成瓶內負壓，再注入1/10瓶體積的乙炔氣作為固氮酶底物。小瓶置28 ℃反應2 h后用微量進樣器從每個小瓶中抽取100 μL氣體注入氣相色譜進樣室中，記錄檢測結果。取樣完畢后用鑷子摘下根瘤并稱質量，計算樣品的固氮酶活性。

1.4 蛋白的誘導表達與純化

將經鑒定的重組載體轉化到大腸桿菌表達菌株中，挑取單菌落于4 mL相應抗性的LB液體培養基中，37 ℃過夜培養。按照1%接種量接種震蕩培養至D600=0.4～0.6。加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，16 ℃培養18 h后收集菌體。用10 mL PBS溶液重懸菌體后液壓破碎細胞破碎3次，對總蛋白取樣。4 ℃ 8 000 r/min 將破碎后的液體離心1 h。

用0.45 μm的過濾器過濾細胞破碎液離心后的上清，取上清樣10 μL，加10 mL過濾后的上清蛋白液至純化柱中，4 ℃搖床旋轉1 h孵育，取下底部蓋子，讓液體自然流出，取樣竄流液10 μL。加10 mL的磷酸緩沖液至純化柱中，用槍吹打混勻，靜置10 min，取下底部蓋子，讓液體自然流出。重復2～3次，并取樣10 μL。加入1 mL的10 mmol/L還原性谷胱甘肽溶液，4 ℃搖床旋轉孵育20 min，取下底部蓋子使液體自然流出，即得到純化好的蛋白，取樣10 μL。分裝至無菌的1.5 mL 離心管，液氮速凍后放至-80 ℃冰箱備用。對蛋白純化柱填料進行清洗和保存。對所取樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.5 兩親本雜交法介導的基因敲除

培養根瘤菌MAFF303099和S17-1菌株至對數生長期。分別收集1 mL菌體。TY液體培養基重懸。重復離心、加無抗TY洗滌1次。然后1 000 r/min離心1 min收集洗滌2次后的菌體。用30～50 μL的無抗TY液體培養基重懸2種菌體，并將菌體混合液滴在0.22 μm的微孔濾膜上，置于TY平板。28 ℃培養2 d后用無菌水將菌體從濾膜上洗脫并重懸；取200 μL菌懸液涂布于含慶大霉素(50 μg/mL)、磷霉素(100 μg/mL)和10%蔗糖的TY固體培養基上，28 ℃倒置培養至長出單菌落。菌落PCR驗證上下臂是否發生同源重組交換。

1.6 碘-碘化鉀染色法觀察根瘤內淀粉粒

將包埋好的石蠟塊于-20 ℃預冷10 min后固定在樣品夾上，設置切片厚度為5 μm，使用徠卡切片機進行切片，將組織置于干凈的載玻片上，滴加40%的乙醇預展片，后置于42 ℃的水浴鍋中充分展片。組織切片置于載玻片上，做好標記，55 ℃烘片3 min。于染色缸中用二甲苯浸泡石蠟切片15 min，并重復該操作3次；之后用95%、85%、75%乙醇依次于染色缸中浸泡切片各15 min，用碘液將組織染色10 min，傾去染液后快速水洗；甩干水，于60 ℃烘4～6 h后用二甲苯透明3 min，蓋上蓋玻片用體式顯微鏡和光學顯微鏡對染色后的根瘤切片進行觀察并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 共生表型統計

前期研究篩選出MAFF303099在共生固氮過程中的上調表達基因(Δmlr2566、Δmll4860、Δmll5060、Δmlr5883、Δmlr6114、Δmll6127、Δmlr6132、Δmlr6210、Δmlr7570和mlr7572)，通過兩親本雜交和同源重組方法構建了相應的10株基因敲除突變體菌株。將這些突變體菌株接種至野生型百脈根，觀察植物固氮酶活性和結瘤數表型，探討突變體根瘤菌對其共生固氮的影響。

對百脈根植株分別接種10種不同根瘤菌突變體，發現根瘤菌突變體所形成的根瘤菌數量與野生型根瘤菌相比沒有顯著差異(表1)。但Δmlr5883菌株固氮酶活性顯著下降(圖1)，且3次重復實驗表型穩定。故后續以該基因為主，探究mlr5883在共生固氮中發揮的作用。

表1 突變體結瘤數和固氮酶活性表型統計 Table 1 Nodules number and nitrogenase activity of mutants phenotype

誤差線表示標準差；**表示在1%的水平上的顯著差異,(n>50)。下同。Error bars denote SE；** means significant differences at P<0.01(n>50).The same as follows.

2.2 生物信息學分析

mlr5883有1 191個堿基，可編碼形成具有396個氨基酸的蛋白產物。Uniprot網站(https://www.uniprot.org/)預測該蛋白具有天冬氨酸氨基轉移酶，催化L-天冬氨酸轉氨基至α-酮戊二酸形成草酰乙酸和L-谷氨酸。SMART網站預測在mlr5883的63～205堿基處有一個氨基轉移酶結構域。

mlr5883的敲除導致固氮酶活性的下降，但并不完全喪失酶活性。推測可能在MAFF303099中存在仍能發揮相同功能的酶或者存在其他并行生化途徑。為探究是否由于同功蛋白致使Δmlr5883菌株仍具有部分固氮功能，在MAFF303099基因組和2個共生大質粒上檢索具有潛在天冬氨酸轉氨酶功能的基因，采用最大似然法經自舉法檢驗(bootstrap檢驗)構建蛋白分子進化樹(圖2A)，結果顯示，質粒pLMa上的2個基因產物MLR9118和MLR9116與MLR5883有最大的相似性，同一性分別為67.7%和50.0%。采用相同的方法對與同源性最近的mlr9118進行單敲除，并未發現固氮酶活性與野生型有顯著變化(圖2B)。據此可以推測，MAFF303099在與百脈根的共生固氮過程中，mlr5883作為主要功能基因發揮天冬氨酸轉氨酶作用，為驗證這一假設，筆者曾嘗試同時對mlr5883、mlr9118和mlr9116實行多基因敲除，但未能成功。

A:MLR5883的分子進化樹; B：Δmlr5883,Δmlr9118 和野生型菌株固氮酶活性。誤差線表示標準誤；*表示在5%的水平上的顯著差異(n>50)。A:Molecular evolutionary tree of MLR5883； B：Nitrogenase activity of Δmlr5883,Δmlr9118 and wide type. Errow bars denote SE；** means significant differences at α=0.05(n>50).

2.3 MLR5883天冬氨酸轉氨酶(AAT)活性驗證

為了測定MLR5883編碼蛋白是否具有預測的天冬氨酸氨基轉移酶功能，構建pGEX-4T-1/MLR5883蛋白表達載體，原核誘導表達可溶性的目的蛋白。網站預測的目的重組蛋白大小約為69 ku，考馬斯亮藍染色結果顯示,靠近75 ku條帶位置下方存在一明顯條帶，與預測蛋白大小相近(圖3)。經GST標簽純化后的蛋白質量濃度為0.21 mg/mL。根據標準曲線計算得到純化的重組蛋白天冬氨酸氨基轉移酶活性為16.67 U/mg。證明MLR5883編碼蛋白具有AAT酶活性。

M為ABclonal蛋白marker (RM19001) ； 泳道1為純化蛋白樣品。M:Protein marker; Lane 1:Elution protein sample 20 μL.

2.4 根瘤組織中侵染細胞形態與淀粉粒的觀察

為了探究導致固氮酶活性下降的原因，首先對根瘤組織中的侵染細胞形態進行觀察。根據以往的研究[14]推測該基因參與根瘤菌與植物共生時碳源的代謝，故對根瘤中淀粉粒情況進行觀察。

觀察結果(圖4)顯示：野生型和Δmlr5883菌株所形成的根瘤中侵染細胞在形態上沒有顯著差異，淀粉顆粒的大小和數量發生顯著改變。野生型根瘤中的淀粉粒數量較多，直徑較大。而突變體形成的根瘤中淀粉顆粒的數量大大減少，且直徑更小。

2.5 Δmlr5883回補表型的觀察

構建回補載體pBBR1-MCS3/ox-mlr5883，將其接合轉入Δmlr5883中。接種野生百脈根MG-20，共培育21 d后觀察共生表型。結果顯示，21 d后接種不同種根瘤菌和不接種根瘤菌的植物的生長狀態有區別。不接種的百脈根植株長勢最弱小(圖5A)，根系上沒有根瘤形成，表現為明顯的缺氮表型。其次為接種只含質粒的Δmlr5883對照組(圖5B)，與接種回補根瘤菌和野生型根瘤菌的植株相比較為弱小。接種了mlr5883回補菌株的百脈根苗(圖5C)長勢與接種野生型的百脈根苗(圖5D)長勢相近甚至更好，但差異不顯著。植株表型與固氮酶活性的測定結果相吻合，固氮酶活性最高的為回補菌株形成的根瘤，其次為野生型，突變體長勢最差并與前兩者相比有顯著差異(圖5E)。同時還發現三者的結瘤數量與固氮酶活性的趨勢恰好相反，但對三者結瘤數量進行統計分析并沒有發現顯著差異(圖5F)。

A：甲苯胺藍染色觀察侵染細胞形態; B：體式顯微鏡下碘-碘化鉀染色法觀察根瘤內淀粉粒; C：普通光學顯微鏡觀察根瘤內淀粉粒。A：Toluidine blue staining to observe the morphology of infected cells; B：Amyloplasts are stained with potassium iodide,images are taken by a sereoscopic microscopes; C:Amyloplasts are stained with potassium iodide,images are taken by a optical microscope. WT:野生型 Wild type; CK:對照，未加碘化鉀染色 Control check,without potassium iodide stained.

3 討 論

本研究選取百脈根中慢生型根瘤菌MAFF303099在成熟根瘤中表達上調的基因,構建了相關基因敲除突變體菌株，鑒定了這些突變體菌株與百脈根共生過程中的結瘤固氮表型。其中mlr5883編碼一個天冬氨酸氨基轉移酶(AAT)。已有的研究表明在形成不定型根瘤的苜蓿根瘤菌中，其AAT突變后會導致Fix-(結瘤不固氮)表型[12]，而敲除了mlr5883的MAFF303099菌株導致固氮酶活性降低，根瘤中淀粉顆粒的大小與數量發生變化。對該基因回補表達后固氮酶活性提升至野生型水平，這些結果表明MAFF303099中mlr5883在百脈根共生固氮中發揮重要作用。在苜蓿根瘤菌與百脈根根瘤菌中敲除AAT基因，兩者接種植物后其共生固氮表型有差異，可能原因一是由于不定型根瘤與定型根瘤代謝差異所導致，二是mlr5883在百脈根根瘤菌中有2個同源基因，它們可能存在功能冗余現象。

接種Δmlr5883突變根瘤菌所形成根瘤的固氮酶活性的降低與植物提供碳源變化存在關聯，具體機制需要進一步的試驗證明。在類菌體吸收植物供給碳源的過程中，普遍認為植物來源的蘋果酸在蘋果酸脫氫酶(MDH)作用下生成草酰乙酸，草酰乙酸在檸檬酸循環中代謝，為類菌體維持自身生理生化反應和固氮反應供能[15-16]。Mcdermott等[17]認為存在跨類菌體膜的蘋果酸/天冬氨酸循環，該循環可為固氮反應提供還原當量但不涉及碳源的轉運。AAT為該循環所必需的關鍵酶。但蘋果酸/天冬氨酸循環中涉及的底物轉運在一些共生關系中速率較低。故蘋果酸/天冬氨酸循環跨類菌體膜是否真實存在仍有較多疑點。與不定型根瘤AAT突變體的Fix-表型[12]相比，本研究再次驗證了根瘤器官的代謝多樣性[18]。對于類菌體中AAT如何影響根瘤中氨基酸代謝和碳源代謝仍需要進一步探究。

A-D為接種21 d后百脈根植株生長狀態， A：未接種； B：接種Δmlr5883/pBBR1-MCS3； C：Δmlr5883/pBBR1-MCS3-ox-mlr5883； D：接種野生型MAFF303099; E：3種菌株的固氮酶活性； F：3種菌株的結瘤數。A：The growth state of the MG20 without incubation with rhizobium at 21 dpi; B：The growth state of the MG20 incubation with Δmlr5883/pBBR1-MCS3 at 21 dpi; C：The growth state of the MG20 incubation with Δmlr5883/pBBR1-MCS3-ox-mlr5883 at 21 dpi; D：The growth state of the MG20 incubation with wild type M.loti MAFF303099 at 21 dpi; E：Nitrogenase activity of ox-mlr5883,vector and wide type. The nitrogenase activity was measured 21 days after inoculated; F:Nodules number of ox-mlr5883,vector and wide type.

本研究證實百脈根根瘤菌MAFF303099中mlr5883基因所編碼的天冬氨酸轉氨酶參與調控固氮過程，該基因的缺失對根瘤中淀粉顆粒積累產生影響。該基因可能通過參與類菌體中植物供給碳源的代謝和利用，從而影響固氮過程。這些研究為解析共生固氮中的根瘤菌與豆科植物的碳氮代謝及物質交換過程提供證據，為深入研究共生固氮的作用機制奠定基礎。