貝殼杉烯酸誘導煙草的系統獲得性抗性防御番茄斑萎病毒侵染

趙立華，楊婷婷,2，邱潤霜，何思潔,2，余 萍，鄭 雪，張麗珍，張仲凱*

(1.云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所/云南省農業生物技術重點實驗室/農業農村部西南作物基因資源與種質創制重點實驗室，云南 昆明 650205；2.西南林業大學園林園藝學院，云南 昆明 650224)

【研究意義】番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt orthotospovirus，TSWV)在世界范圍內廣泛發生分布，為害多種作物引起嚴重的經濟損失，因其經濟重要性和科學重要性被列為世界十大病毒之第2位[1]。TSWV近年來已在中國18個省(區、市)快速發生蔓延，嚴重危害番茄、辣椒、煙草、萵苣、葫蘆科等作物。1997年，根據感病植株葉部組織的電子顯微鏡觀察，在云南煙草中首次發現了疑似TSWV的病毒粒體;2010年，基于核殼體蛋白N基因測序及其推導的氨基酸序列分析正式報道云南煙草中發現TSWV[2-3]。TSWV是正番茄斑萎病毒屬(Orthotospovirus)的代表種，屬于布尼亞病毒目(Bunyavirales)番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)，其中Orthotospovirus是唯一侵染植物的屬[4]。TSWV通過薊馬傳播，且能在薊馬體內復制增殖，西花薊馬(Frankliniellaoccidentalis)是中國云南TSWV的主要傳播介體[5]。TSWV是目前已知寄主范圍最廣的植物病毒，侵染番茄(Solanumlycopersicum)、煙草(Nicotianatabacum)、辣椒(Capsicumannuum)、南瓜(Cucurbitamoschata)、芹菜(Celerycoriandrumsativum)和豇豆(Vignaunguiculata)等84科1000多種植物，給農業生產造成了嚴重的經濟損失[6-11]。由于抗病品種缺乏與病毒突變、重組產生新株系等原因，目前對TSWV引起的病害尚無特效的防控方法，生物源抗病毒誘導劑是近年來病毒病防控的重要途徑之一。筆者擬在前期研究基礎上探明貝殼杉烯酸(Kaurenic acid,3α-Angeloyloxy-9β-hydroxy-ent-kaur-16-en-19-oil acid,AHK)對TSWV侵染煙草誘導系統獲得抗性的抑制機制，為生物源抗病毒農藥研發篩選先導化合物。【前人研究進展】決明子(Cassiaobtusifolia)中分離的酚類化合物、腫柄菊(TithoniadiversifoliaA.Gray)中提取的倍半萜類化合物Tagitinin C和1β-methoxydiversifolin-3-0-methyl ether、桂皮(Cortexcinnamomi)、石蒜(Lycorischinensistraub)和百部(Stemonajaponica)中分離的生物堿類、石斛(Dendrobiumnobile)中分離的多糖等多種活性化合物具有抑制煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)侵染的活性[12-17]。三裂蟛蜞菊中提取的桉烷內脂類和二萜類化合物能通過提高PAL等生物防御酶活性抵御TMV侵染[18]。腫柄菊中提取的倍半萜類化合物Tagitinin A和三裂葉蟛蜞菊(Wedeliatrilobata)中提取的AHK能通過誘導JA通路抑制TSWV侵染[16,19-20]。其中，AHK在對TSWV接種煙草前后處理均有抑制效果，抑制率分別為62.40%、76.50%，超過對照農藥寧南霉素[20]。【本研究切入點】通過AHK在TSWV接種烤煙品種K326(Nicotianatobacumcv K326)前、后處理，檢測與系統抗性相關的酶活性與代謝通路關鍵轉錄因子基因的表達量，探索AHK誘導寄主植物對TSWV侵染的抑制機制。【擬解決的關鍵問題】明確AHK誘導寄主植物系統獲得抗性抑制TSWV侵染的關鍵酶及其活性變化以及主要代謝通路的關鍵轉錄因子基因，為揭示其防御機理、研發生物源抗病毒誘導劑積累基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

普通煙烤煙主栽品種K326和TSWV毒源(TSWV-YN)，由云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所植物病毒實驗室保存。化合物貝殼杉烯酸(AHK)，由中國科學院昆明植物研究所李順林研究員提供。二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)購自SbaseBio生物公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 防控實驗 選擇生長一致的5～6葉期健康煙苗，先摩擦接種 TSWV，10 min后用清水沖洗，24 h后再均勻涂抹AHK (200 μg/mL)，10 min后用清水沖洗；陽性對照為先摩擦接種 TSWV，24 h后涂抹雙蒸水(ddH2O)；陰性對照為先涂抹ddH2O，24 h后涂DMSO。實驗樣品設3個重復，實驗重復3次。

1.2.2 預防實驗 選擇生長一致的5～6葉期健康煙苗，先均勻涂抹化合物AHK(200 μg/mL)，10 min后用清水沖洗，6 h后摩擦接種 TSWV，10 min后用清水沖洗；陽性對照為先涂抹ddH2O，6 h后接種TSWV；陰性對照為先涂抹ddH2O，6 h后涂抹二甲基亞楓(DMSO)。實驗樣品設3個重復，實驗重復3次。

1.2.3 煙草抗病性相關的關鍵酶活性測定 選擇生長一致的5～6葉期健康煙苗，分別進行預防實驗和防控實驗，于0、1、2、3、4和5 d采取接種葉樣品進行檢測。按照試劑盒說明書(北京索萊寶科技有限公司，中國)分別提取苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia lyase，PAL)、過氧化物酶(Peroxidase,POD)和SOD，用分光光度計測定PAL、POD 和SOD分別在290 、470和 560 nm的吸光值(OD值)，按照試劑盒所給公式計算酶活。每組樣品設置5個重復。

1.2.4 煙草防御相關蛋白基因的實時熒光定量RT-PCR(RT-qPCR) 檢測寄主相關防御基因復制量變化。根據試劑盒TriPure Isolation Reagent (Roche Diagnostics GmbH公司，美國)的說明從煙葉中提取總 RNA，按照反轉錄試劑盒TransScript II First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(北京全式金公司)的操作將上述提取的總RNA反轉錄完成第1鏈 cDNA 的合成，RT-qPCR檢測按照FastStart Universal SYBR Green Master(Box)(Roche Diagnostics GmbH公司,美國)設定反應體系及反應條件。本研究用到的引物列于表1。用含有相應基因序列的質粒 DNA 建立標準線，按照10-2、10-3、10-4、10-5和10-6稀釋標準樣品。

表1 用于煙草防御相關蛋白基因的RT-qPCR檢測引物

2 結果與分析

2.1 AHK對抗病相關酶活性的影響

2.1.1 AHK對PAL活性的影響 單一AHK處理可以誘導煙草PAL酶活性升高，在處理后第1和3天活性達到高峰(圖1-A，1-B)，在防控作用(TSWV+AHK)和預防作用(AHK+TSWV)中PAL活力在第2天達到高峰。TSWV+AHK處理后到第4天PAL活力一直低于AHK處理，在陽性對照(只涂抹TSWV)和空白對照(只涂抹DMSO)中PAL活性低于AHK和TSWV+AHK處理(圖1-B)，結果表明AHK本身能誘導PAL活性升高，但只在預防作用中抵御TSWV侵染起到一定的作用。

2.1.2 AHK對POD活性的影響 AHK可以誘導過氧化物酶(Peroxidase,POD)活性升高，在防控作用(TSWV+AHK)和預防作用(AHK+TSWV)中POD活力雖然有所升高，但低于對照AHK處理，陽性對照(只涂抹TSWV)和空白對照(只涂抹DMSO)中POD活力處于低水平狀態(圖1-C，1-D)，結果表明AHK本身能誘導POD活性升高，但在預防作用和防控作用中抵御TSWV侵染時未起到明顯作用。

2.1.3 AHK對SOD活性的影響 AHK可以誘導超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)在處理后第1和4天活性達到高峰，在防控作用(TSWV+AHK)和預防作用(AHK+TSWV)中SOD活力在第2天達到高峰且SOD活力高于AHK處理，在陽性對照(只涂抹TSWV)和空白對照(只涂抹DMSO)中SOD活性低于AHK、TSWV+AHK及AHK+TSWV處理(圖1-E，1-F)，結果表明AHK本身能誘導PAL活性升高，且在預防作用和防控作用中抵御TSWV侵染起到積極作用。

2.2 AHK對誘導SAR轉錄因子關鍵基因表達量的影響

2.2.1 AHK對接種葉中相關基因表達量的影響 采用熒光定量RT-qPCR方法測定PR1a、PR1b、MYC2、NAC4個基因在接種葉中表達量。陰性對照(DMSO)的PR1a基因在0.5 h表達量達到高峰(圖2-A)，對照(DMSO)的PR1b、NAC基因在1 h表達量達到高峰，AHK處理和陽性對照(TSWV)接種葉中PR1a、PR1b、NAC基因表達量低于陰性對照(DMSO)(圖2-B，2-D)。AHK處理后MYC2基因表達量在1 h達到高峰，陽性對照(TSWV)和陰性對照(DMSO)中MYC2基因表達量一直處于低水平狀態(圖2-C)。結果表明AHK在接種葉中主要誘導了MYC2基因表達量升高。

2.2.2 AHK對接種葉中相關基因表達量的影響 系統葉(接種葉上一葉)中防御基因表達量的變化能進一步說明AHK通過誘導寄主的系統抗性抵御TSWV侵染。采用熒光定量RT-qPCR方法測定PR1a、PR1b、MYC2和NAC4個基因在接種葉中的表達量。AHK處理后PR1a、PR1b分別在第3和2小時達到高峰，且高于陽性對照(TSWV)和陰性對照(DMSO)(圖3-A，3-B)。AHK處理后MYC2基因表達量在第3小時到達高峰，且高于陽性對照(TSWV)和陰性對照(DMSO)(圖3-C)。NAC基因在AHK處理和陰性對照(DMSO)中表達量在第3小時達到高峰，但是DMSO中NAC基因表達量高于AHK處理(圖3-D)。結果說明AHK不僅誘導接種葉中MYC2基因表達量升高，同時也誘導系統葉中MYC2基因表達量升高，MYC2是茉莉酸(Jasmonic acid，JA)信號通路的關鍵基因，因此AHK可能通過誘導JA通路抵御TSWV侵染。

3 討 論

3.1 天然產物誘導寄主植物酶活性增加對系統獲得抗性增強的效應

在抵御病原微生物侵染的過程中PAL、POD 和 SOD 等生物防御酶發揮著重要作用。PAL 是苯丙烷代謝途徑關鍵酶，能誘導作物的獲得性系統抗性(Systemic acquired resistance,SAR)抵御病原微生物侵染[21]，POD可以催化H2O2還原，誘導SA、木質素和抗毒素的合成，引起植物的免疫應答，抑制病原菌的增殖[22]。SOD是生物體抗氧化系統第一道防線，能有效清除生物體內活性氧[23]。前人研究發現生物堿化合物、香菇多糖硫酸酯、硫脲化合物、桉葉內脂類化合物能通過提高寄主體內PAL、POD、SOD活性，增強植物對TMV的抵御能力[15,24-27]。本研究發現活性化合物AHK在防控作用和預防作用中主要誘導SOD活性升高，以此增強清除活性氧的能力，同時調節植物體內光合作用、呼吸作用等生理活動，誘導植物系統抗性抵御TSWV的侵染。

3.2 天然產物誘導寄主植物SA和JA信號通路對防御病毒侵染的抑制效果

病程相關蛋白(Pathogenesis-related proteins,PRs)是植物受病原物侵染或非生物因子刺激后產生的一系列蛋白，通過誘導寄主的SAR有效抑制病原體的生長、繁殖和擴散[28-29]，研究表明PR蛋白家族中PR1與植物的SAR相關[30-32]。TSWV侵染能通過誘導寄主SA通路增強作物的基礎抗性，本研究中發現TSWV侵染誘導了寄主SA通路關鍵基因PR1a和PR1b基因的表達，與前期研究結果一致[33]。NAC代表了一大類植物特異性轉錄因子，這些因子與生物的發育、衰老和防御相關，并且NAC轉錄因子參與JA信號通路[34-37]。本研究中NAC表達量有一定升高，說明NAC在化合物AHK誘導寄主抗性抵御TSWV侵染的過程中起到一定輔助作用。MYC2是JA通路的轉錄因子，MYC2轉錄因子與JAZ蛋白以及COI1基因通過ZIM結構域相互作用，當JA通路激活時，JAZ蛋白被26S蛋白酶體降解進而釋放MYC2等轉錄因子使JA通路發揮作用[38]。本研究中AHK處理后接種葉和系統葉中都MYC2表達量相比于對照升高，AHK通過誘導SOD活性升高以及抗性相關轉錄因子表達量升高進而誘導寄主系統抗性抑制TSWV侵染，研究結果對研發新型抗病毒植物源藥劑，實現病毒病的綠色防控奠定了理論基礎。

4 結 論

AHK與TSWV共同作用，促進了寄主植物煙草SOD活性增強，同時通過誘導JA信號通路關鍵酶基因MYC2的高效表達增強了煙草植株對TSWV侵染的防御能力。AHK具有開發為生物源抗病毒誘導劑應用于TSWV引起的病害的綠色防控的潛力。