阿司匹林對子癇前期發病的預防作用及機制

劉亞軍 趙蕾 石萍 張文軻 張寧

(青島大學附屬醫院產科，山東 青島 266555)

子癇前期(PE)是發生于妊娠期間的一種疾病，患者主要表現為高血壓及蛋白尿，可導致子癇、胎盤早剝、胎兒生長受限、早產等嚴重的母兒并發癥。目前，PE的病因尚未完全闡明，關于其發病機制有多種學說，螺旋動脈的滋養細胞浸潤不足及子宮胎盤局部缺血缺氧是比較重要的學說之一。基質金屬蛋白酶(MMP)在子宮胎盤血管重建中有著重要作用。研究顯示MMP-2、MMP-9在 PE患者胎盤組織中表達水平下調[1]，但具體的調控機制并不清楚。炎性學說是PE發病的另一重要機制，PE患者血清及胎盤中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種炎性因子水平明顯升高[2]，胎盤缺血也會刺激母體血液及胎盤中TNF-α的釋放[3]。研究顯示，TNF-α可能是通過影響MMP的表達參與子宮血管異常重建并導致胎盤缺血[4]，但對于PE發生時血清中TNF-α與胎盤組織中MMP-2、MMP-9相關性研究報道不多。目前，建議PE高風險孕婦在妊娠12周后每日口服小劑量阿司匹林以預防PE，而在妊娠>16周后服用效果不佳，妊娠第12～16周正是胎盤發育的關鍵時期，因此推測阿司匹林可能是通過改善胎盤血管重建發揮預防作用的。本研究旨在探討TNF-α是否是通過抑制胎盤組織中MMP-2及MMP-9的表達及活性參與PE的發病，而阿司匹林是否通過減弱TNF-α的抑制作用而達到預防PE發病的。現將結果報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2019年2—5月在我院產科行剖宮產的20例PE產婦作為研究對象(PE組)，另選取同期行剖宮產的20例正常妊娠產婦作為對照組(NP組)。排除胎膜早破及合并感染性疾病者。兩組研究對象的年齡、孕周、體質量指數、產次比較差異均無統計學意義(P>0.05)。臨床樣本的采集、使用均獲患者知情同意。

1.2 樣本的采集及處理

所有研究對象在術前空腹狀態下采集靜脈血，離心后分離血清，以ELISA法檢測血清中TNF-α的表達水平。剖宮產時留取胎盤組織，-80 ℃保存備用。

1.3 Western-blot法測定人胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達水平

取人胎盤組織60 mg，剪碎，加入300 μL蛋白裂解液，勻漿，4 ℃下12 000 r/min離心15 min后取上清液；測定蛋白濃度后，經SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜，以體積分數0.05脫脂奶粉封閉，分別加入單克隆兔抗MMP-2抗體(1∶1 000)、單克隆兔抗MMP-9抗體(1∶1 000)孵育過夜；洗膜后加入辣過氧化物酶標記的羊抗兔二抗( 1∶1 000)孵育2 h，以β-actin作為內參照，曝光后用Image J軟件分析條帶的灰度值，以目的蛋白/內參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平，實驗均重復3次，結果取均值。

1.4 妊娠大鼠處理及樣本采集

妊娠11 d的Sprague-Dawley大鼠18只(查爾斯河實驗室)，體質量205～350 g，標準食物喂飼，自由飲水，在12-12 h晝夜循環環境中生長。在妊娠第14天，將大鼠隨機分為正常妊娠組(C組)、TNF-α組(B組)、TNF-α+阿司匹林組(A組)，每組6只大鼠。妊娠第14天，所有大鼠吸入異氟烷麻醉后行頸靜脈置管， C組大鼠經頸靜脈每天將50 mL生理鹽水持續泵入，B組大鼠每天將TNF-α 50 ng加入到生理鹽水50 mL中持續泵入， A組在B組處理的基礎上同時給予摻有阿司匹林的嚙齒動物面團喂養，均連用5 d。阿司匹林的劑量參照目前高危孕婦推薦的100 mg/d 的劑量[5]進行換算，為阿司匹林1.5 mg/kg。至妊娠第19天，通過吸入CO2致大鼠安樂死，打開腹腔切開妊娠子宮，取出胎盤組織，-80 ℃保存備用。所有程序均嚴格按照《實驗動物科學與管理》的相關規定進行。

1.5 Western-blot方法測定大鼠的胎盤組織當中MMP-2、MMP-9的表達水平

取大鼠胎盤組織，同1.3中的方法檢測各組大鼠胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達水平，實驗均重復3次，結果取均值。

1.6 明膠酶譜法測定大鼠胎盤組織中MMP-2、MMP-9的活性

同1.3中的方法裂解蛋白，裂解液不含DTT；提取蛋白后進行SDS-PAGE凝膠電泳(分離膠中加入濃度為1 g/L的明膠)，跑膠后，取出膠加入復活緩沖液反應0.5 h恢復酶的活性；再將膠放至反應緩沖液中37 ℃孵育過夜，第2天以5 g/L的考馬斯亮藍染色0.5 h，反應緩沖液脫色至出現白色條帶，采用Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白/內參蛋白條帶的灰度值比值表示目的蛋白酶的活性。

2 結 果

2.1 兩組血清中TNF-α以及胎盤組織中MMP-2、MMP-9表達水平比較

PE組和NP組患者血清中TNF-α的表達水平分別為(349.8±10.46)、(236.5±11.82)ng/L，兩組比較差異有顯著性(t=7.18，P<0.05)。PE組患者胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達水平分別為0.72±0.01、0.75±0.01，NP組患者分別為0.85±0.01、0.83±0.01，兩組比較差異有顯著性(t=6.52、5.81,P<0.05)。見圖1。

相關性分析結果顯示，PE患者血清中TNF-α的表達水平與胎盤組織中MMP-2、MMP-9表達水平呈負相關(r=-0.64、-0.61，P<0.05)。

2.2 3組妊娠大鼠胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達水平及活性比較

A、B、C組大鼠胎盤組織中MMP-2表達水平分別為0.25±0.04、0.11±0.02、0.22±0.03，MMP-9的表達水平分別為0.44±0.06、0.18±0.02、0.34±0.05，3組比較差異有顯著意義(F=56.21、126.50，P<0.05)，其中B組大鼠的胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達水平均明顯低于C組，A組均明顯高于B組(t=9.62～16.36，P<0.05)。見圖2。

圖2 3組妊娠大鼠胎盤組織中MMP-2、MMP-9表達水平比較

A、B、C組妊娠大鼠胎盤組織中MMP-2活性分別為0.37±0.07、0.19±0.08、0.27±0.08，MMP-9的活性分別為0.98±0.45、0.38±0.26、0.65±0.35，3組比較差異均具有顯著意義(F=7.53、4.05，P<0.05)，其中B組大鼠胎盤組織中MMP-2、MMP-9的活性均明顯低于C組，A組均明顯高于B組(t=2.83～4.15，P<0.05)。見圖3。

圖3 3組妊娠大鼠胎盤組織中MMP-2、MMP-9活性比較

3 討 論

PE是一種妊娠相關的特發性疾病，其主要的臨床特點是高血壓，有時伴有蛋白尿和水腫，可導致胎兒宮內生長受限、胎盤早剝、醫源性早產等嚴重并發癥[6-7]。PE患者臨床普遍采用降壓、解痙、鎮靜等藥物治療，但因病因復雜，治療效果較差，甚至不得不終止妊娠。但即使終止妊娠后，部分患者仍然長期伴有慢性高血壓或者其他心血管系統疾病[8]。因此明確PE的具體發病機制對于該病的預防及治療意義重大。

目前認為，PE的發病可能與胎盤淺著床、遺傳易感性、過度炎癥反應、內皮細胞功能障礙、母胎免疫平衡失調等多種因素有關，其中關于子宮胎盤灌注壓減少及其導致的胎盤缺血缺氧的機制比較受關注，認為胎盤缺血缺氧可能會增加全身及胎盤局部生物活性因子的釋放，繼而發生廣泛性血管功能障礙，并導致高血壓。該機制涉及到血管系統、免疫系統及炎癥反應因素等，各因素間具有相互影響[9-10]。

研究表明，胎盤血管重建異常是導致胎盤缺血缺氧的關鍵因素，滋養細胞侵襲能力等多種因素與胎盤血管重建、胎盤缺血缺氧等密切相關[11-12]，其中MMP是調節胎盤血管重建的關鍵因子[13]。MMP是一類可降解細胞外基質和結締組織的蛋白酶，其中MMP-2和MMP-9在動物和人類的妊娠組織重塑及胎盤血管重建中均具有重要作用。研究顯示，正常妊娠大鼠的子宮肌層和主動脈組織中MMP-2、MMP-9的表達上調[4]，且MMP-2、MMP-9基因多態性與PE的發病相關[14]。本研究結果表明，PE患者胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達低于正常妊娠者，與OMRAN等[15]的研究結果一致。MMP表達水平降低會導致膠原細胞過度沉積，從而影響子宮平滑肌細胞生長和抑制滋養細胞侵入螺旋動脈，影響胎盤血管重塑。此外，MMP的異常表達可能還會導致母體耐受性降低、侵襲性滋養細胞凋亡、螺旋動脈重塑不足以及子宮灌注壓降低等一系列反應[16]。因此在理論上調控MMP的表達水平可能會改善子宮胎盤血管重建，從而降低PE的發生概率，而調控MMP表達的上游因子目前尚不清楚。

研究發現，血液循環系統中TNF-α等多種炎性因子水平升高，可能是導致PE發病的重要因素[17]。LI等[18]研究顯示，TNF-α可促進缺血誘導的PE模型大鼠子宮胎盤組織中MMP-1和MMP-7的表達。因此推測TNF-α可能是通過影響MMP的表達參與了PE發病，所以本研究進一步分析了TNF-α與MMP表達的相關性。本研究結果顯示，B組胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達水平及活性下降，且PE患者血清中TNF-α的表達水平與胎盤組織中MMP-2、MMP-9表達水平呈負相關。提示TNF-α可能是MMP的上游調節因子，通過抑制胎盤組織中MMP-2、MMP-9表達，致妊娠時子宮胎盤重塑不足、血管內皮細胞功能障礙，從而誘發PE。

臨床研究顯示，高危孕婦早期服用低劑量阿司匹林可降低早期PE發病風險[19]。SUN等[20]研究發現，阿司匹林可通過抑制胎盤及血清中炎性因子釋放來改善脂多糖誘導的PE樣癥狀。XU等[21]研究顯示，TNF-α可抑制滋養細胞向內皮細胞網絡的整合，阿司匹林可抑制TNF-α的這一作用，改善滋養細胞與內皮細胞網絡整合的能力。本研究結果顯示，阿司匹林可逆轉孕鼠血清中TNF-α對MMP-2、MMP-9的抑制作用，提示阿司匹林可能是通過逆轉血循環中TNF-α對MMP-2、MMP-9的抑制作用這一途徑，改善胎盤血管重建，從而預防PE的發生。

綜上所述，本研究顯示，TNF-α可能通過抑制胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達及活性參與PE發病。阿司匹林可抑制TNF-α的這一作用，從而提高胎盤組織中MMP-2、MMP-9的表達水平及活性，此可能是阿司匹林預防PE的潛在機制，但具體的分子機制還有待于細胞實驗進一步研究。