基于動物實驗和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究白竭散保留灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用機(jī)制※

趙夢月 孫曉健 王宏昌 毛細(xì)云

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院2019級碩士研究生，安徽 合肥 230012)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因不明的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要累及結(jié)腸黏膜(下)層，呈間斷性腹痛、腹瀉及黏液膿血便。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療UC雖可改善患者癥狀，但長期使用易出現(xiàn)耐藥性，復(fù)發(fā)率高且易引起變態(tài)反應(yīng)等毒副作用。各類炎癥因子致結(jié)直腸黏膜及其功能損壞是導(dǎo)致UC發(fā)生的重要機(jī)制[1]，故修復(fù)黏膜潰瘍是治療UC的關(guān)鍵。中醫(yī)在止血和斂瘡生肌方面頗具優(yōu)勢，如中藥保留灌腸，藥物直達(dá)病灶，延長藥物與病灶接觸時間，縮短起效時長，不僅提高了生物利用度，且無明顯毒副作用。白竭散為安徽省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，可活血化瘀，止血止痛，生肌斂瘡。本研究基于動物實驗和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘白竭散保留灌腸治療UC的作用機(jī)制。

1 白竭散治療UC實驗研究

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠42只，雌雄各半，體質(zhì)量(240±20)g，購自安徽醫(yī)科大學(xué)，動物許可證號SCXK(皖)2017-001，并通過安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，自由飲食水。

1.1.2 藥品與試劑 白竭散藥物組成：白及、龍血竭。0.23 g/mL白竭散混懸液(安徽省中醫(yī)院)；美沙拉秦灌腸液[Vifor AG Zweigniederlassung Medichemie Ettingen(瑞士)，進(jìn)口藥品注冊證號H20150127]；5%2,4,6-三硝基苯磺酸溶液(TNBS，Sigma)；10%水合氯醛溶液(北京百奧萊博科技有限公司)，4%多聚甲醛固定液(Biosharp)；便隱血試劑盒(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；蘇木精、伊紅染色液(安徽中醫(yī)藥大學(xué)實驗中心)。

1.1.3 儀器 電子天平(梅特勒-托利多集團(tuán))；Olympus CX41顯微鏡(日本Olympus公司)；石蠟切片機(jī)(德國Leica)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模 將42只SD大鼠隨機(jī)抽出10只為空白組，剩余32只大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，將直徑為2 mm的橡膠軟管自大鼠肛門緩慢插入8 cm，注入5% TNBS 0.6 mL，將大鼠倒立2 min，清醒后正常喂養(yǎng)。每日觀察大鼠情況，記錄體質(zhì)量、糞便及隱血情況，若出現(xiàn)體質(zhì)量下降、腹瀉、膿血便，說明經(jīng)過TNBS誘導(dǎo)的大鼠腸道已出現(xiàn)炎癥表現(xiàn)，在32只大鼠中隨機(jī)抽出2只，禁食不禁水，麻醉處死，剪取距肛門約8 cm腸道，400倍顯微鏡下觀察結(jié)腸組織，見黏膜層炎癥改變，潰瘍形成，造模成功。余鼠30只按照隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，模型組、美沙拉秦組、白竭散組，每組10只。

1.2.2 藥物干預(yù)與標(biāo)本處理 造模成功后次日，按動物體表系數(shù)等效劑量法計算，白竭散組予白竭散混懸液2.3 g/(kg·d)灌腸，美沙拉秦組予美沙拉秦灌腸液0.7 g/(kg·d)灌腸，模型組、空白組予0.9%氯化鈉注射液2 mL灌腸。每日固定時間灌腸1次，連續(xù)15 d。療程結(jié)束后各組大鼠禁食不禁水24 h，麻醉處死，剪取距肛門約8 cm腸道，先在400倍顯微鏡下觀察結(jié)腸組織，再用4%多聚甲醛固定液固定48 h，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，最后放置顯微鏡，400倍下觀察HE染色后的組織切片。HE染色過程：脫蠟，覆水，蘇木精染色液染色5 min，伊紅染色液染色1～3 min(根據(jù)染色情況，適當(dāng)增加或減少染色時間)，流水沖洗。

1.2.3 觀察指標(biāo)及方法 ①觀察各組大鼠治療后癥狀表現(xiàn)、結(jié)腸組織損傷情況。②比較各組大鼠疾病活動指數(shù)(DAI)、結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)(CMDI)評分。DIA評分[3]，0分：體質(zhì)量未降，大便結(jié)實，隱血陰性；1分：體質(zhì)量降低1%～5%，大便輕度松散，隱血陰性；2分：體質(zhì)量降低5%～10%，大便松軟，隱血陽性；3分：體質(zhì)量降低10%～15%，腹瀉、稀便，隱血陽性；4分：體質(zhì)量降低>15%，腹瀉，肉眼膿血便。CMDI評分[1]，0分：無損傷；1分：局部充血水腫，無潰瘍；2分：有潰瘍，無明顯炎癥；3分：有潰瘍，1處炎癥；4分：多處潰瘍和炎癥，潰瘍<1 cm；5分：多處潰瘍和炎癥，至少有1處潰瘍>1 cm。③觀察各組大鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果。

1.3 結(jié)果

1.3.1 各組大鼠治療后表現(xiàn)情況 空白組大鼠體質(zhì)量無明顯變化，活動量正常，精神反應(yīng)靈敏，大便質(zhì)軟成形，無黏液膿血便；模型組大鼠活動量減少，體質(zhì)量減輕，大便不成形，見膿血便；美沙拉秦組及白竭散組大鼠精神良好，反應(yīng)尚靈敏，體質(zhì)量基本正常，大便輕度松散，無黏液膿血便。

1.3.2 各組大鼠治療后結(jié)腸組織損傷情況 空白組大鼠結(jié)腸壁結(jié)構(gòu)完整，無損傷；模型組大鼠結(jié)腸壁可見多處潰瘍，大小不等，直徑最大約1.1 cm，炎癥較重；美沙拉秦組及白竭散組大鼠結(jié)腸壁潰瘍面較少，面積較小，炎性反應(yīng)輕。

1.3.3 各組大鼠DAI、CMDI評分比較 見表1。

表1 各組大鼠DAI、CMDI評分比較 分，

由表1可見，模型組大鼠DAI及CMDI評分均高于空白組(P<0.05)；美沙拉秦組、白竭散組大鼠DAI及CMDI評分均低于模型組(P<0.05)；美沙拉秦組與白竭散組大鼠DAI及CMDI評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.3.4 各組大鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果 空白組大鼠腸壁結(jié)構(gòu)完整，未見明顯炎癥細(xì)胞；模型組大鼠腸壁結(jié)構(gòu)不完整，固有腺體及腺上皮杯狀細(xì)胞明顯減少，固有間質(zhì)及腸壁全層可見彌漫大量炎癥細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張充血，黏膜下層水腫明顯，結(jié)構(gòu)紊亂。美沙拉秦組及白竭散組大鼠染色結(jié)果基本一致,腸壁結(jié)構(gòu)基本完整，可見部分修復(fù)，黏膜固有層水腫不明顯，可見少量炎癥細(xì)胞浸潤，固有腺體及其杯狀細(xì)胞數(shù)量較模型組增多，排列稍疏松，黏膜下層及固有肌層未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸HE染色結(jié)果 (HE，×400)

2 白竭散治療UC的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1 軟件及數(shù)據(jù)庫 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)、化源網(wǎng)(http://www.chemsrc.com)、Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)、SwissTargetPrediction &&SwissADME(http://www.swisstargetprediction.ch)、OMIM(https://omim.org)、Therapeutic Target Database(TTD，http://db.idrblab.net/ttd)、GeneCard(https://www.genecards.org)、PharmGKB(https://www.pharmgkb.org)、Drugbank(https://go.drugbank.com)、UniProt(https://www.uniprot.org)、Disgenet(https://www.disgenet.org/)、String(https://cn.string-db.org/cgi/input.pl)，可視化網(wǎng)絡(luò)繪制圖軟件Cytoscape 3.7.2，專業(yè)型化學(xué)結(jié)構(gòu)式編輯器King Draw V 1.2.2,微生信在線繪圖工具(http://www.bioinformatics.com.cn)。

2.2 白竭散有效成分及靶點篩選 以“白及”“龍血竭”為關(guān)鍵詞，通過使用TCMSP、化源網(wǎng)、PubChem數(shù)據(jù)庫檢索，獲得白竭散中部分化合物的分子式，導(dǎo)入“SwissTargetPrediction”，獲得對應(yīng)化合物的結(jié)構(gòu)式，對于其他無法直接獲得化學(xué)分子式及結(jié)構(gòu)式的化合物，通過文獻(xiàn)[4-5]查閱出該類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，使用“King Draw V1.2.2”繪制出對應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式，將所有獲取的化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入“SwissADME”，研究物種選擇“人類”，以可能性≥0.12，將篩選完的成分進(jìn)行靶點預(yù)測，獲得115個化合物，500個基因靶點，基于數(shù)據(jù)庫“Uniprot”，進(jìn)行人類基因的名稱轉(zhuǎn)換、規(guī)范。

2.3 UC疾病靶點檢索與篩選 基于OMIM、TTD、GeneCard、PharmGK、Drugbank、UniProt、Disgenet數(shù)據(jù)庫，輸入“Ulcerative Colitis”檢索，檢索范圍為“智人”獲得人類UC基因，與靶點取交集，構(gòu)建“白竭散-UC靶點Venn圖”，獲得105個交集靶點(見圖2)，獲得白竭散對應(yīng)有效成分106個，見表2。

表2 白竭散有效成分

圖2 白竭散-UC靶點Venn圖

2.4 藥物-有效成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將105個交集靶點與106個有效成分輸入Cytoscape 3.7.2獲得白竭散治療UC潛在靶點，建立“藥物-有效成分-疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)。可見白竭散中同一個活性成分可以作用于多個靶點，不同的活性成分也可作用于相同靶點，充分體現(xiàn)白竭散多成分、多靶點特征。

(BJ:白及，LXJ：龍血竭)圖3 藥物-有效成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集靶點導(dǎo)入String，以置信度≥0.4，得到一個105個節(jié)點、1365條邊、密度0.639的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖4)。以degree由大到小排序，按照degree≥2倍中位數(shù)34為標(biāo)準(zhǔn)，得到核心靶點27個，主要有蛋白激酶B1(Akt1)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、環(huán)氧合酶2(PTGS2)、原癌基因蛋白(JUN)、表皮生長因子受體(EGFR)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、腫瘤壞死因子(TNF)等。

圖4 核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 基因本體生物過程(GOBP)富集分析 采用Metascape對交集靶點進(jìn)行GOBP富集分析，據(jù)P值選取前20類生物過程作圖5，可知其主要富集在炎性反應(yīng)、活性氧代謝等方面。

圖5 GOBP富集分析圖

2.7 京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 將交集靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P值、富集程度、基因數(shù)及相關(guān)研究結(jié)果作為條件，得到癌癥信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-Akt)信號通路、晚期糖基化終末產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE-RAGE)信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)信號通路、Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Jak-STAT)信號通路、TNF信號通路、Toll樣受體 (TLR) 信號通路等25條與UC相關(guān)的信號通路(見表3)。KEGG富集分析、靶點-通路可視化，分別見圖6、7。

圖6 KEGG通路富集分析圖

圖7 靶點-通路圖

表3 KEGG通路富集分析

3 討論

UC為世界性難治性慢性疾病之一，發(fā)病率逐年上升[6]。中醫(yī)藥防治UC經(jīng)驗豐富，較現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有顯著優(yōu)勢。白竭散對局部創(chuàng)面組織中炎癥細(xì)胞有明顯抑制作用，能減輕創(chuàng)面炎性反應(yīng)[6]，增加羥脯氨酸(OHP)含量，提高肉芽組織中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，促進(jìn)創(chuàng)面愈合，減輕疼痛。本實驗用白竭散對UC模型大鼠進(jìn)行灌腸治療，結(jié)果顯示，白竭散治療組大鼠DIA、CMDI評分均較模型組降低(P<0.05)，且與美沙拉秦治療組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)腸組織病理狀況改善，證明白竭散可緩解UC模型大鼠的結(jié)腸黏膜損傷。

白及藥用歷史悠久，可收斂止血，消腫生肌，主要含聯(lián)芐類、菲類、聯(lián)菲類等化合物[7]。白及中黏液質(zhì)在創(chuàng)面上覆蓋形成薄膜，抑制纖溶酶，增加血小板Ⅲ因子活性，形成人工血栓而止血，成為機(jī)械屏障而抗菌，同時白及多糖可抗?jié)儭⒖寡趸谖笣冎锌赏ㄟ^調(diào)控Jak-STAT通路相關(guān)蛋白及氨基末端激酶(JNK)、p38絲裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)蛋白的表達(dá)減輕炎性反應(yīng)，也可抑制PI3K、Akt 表達(dá)發(fā)揮止血作用[7-8]，此外還可增加各類氧化酶活性，有效抑制損傷腸道中TNF-α、NF-κBp65含量[9]。龍血竭可活血化瘀，止痛消腫，斂瘡止血，現(xiàn)代藥理研究證明其有抑制血栓形成、止血、抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧自由基、促進(jìn)表皮修復(fù)等功效，還可改善血小板激活狀態(tài)，下調(diào)TNF-α，減輕UC炎性反應(yīng)，阻斷潰瘍發(fā)展[10]。黃酮類物質(zhì)為其主要成分之一，鎮(zhèn)痛活血功效較強(qiáng)，如劍葉龍血素通過阻斷P物質(zhì)的合成和釋放來抗炎鎮(zhèn)痛，龍血素A可降低血液黏度、纖維蛋白含量，改善血液流動，抑制血栓形成，這可能與PI3K-Akt信號通路有關(guān)；酚類物質(zhì)其第二大類成分，有顯著抗菌消炎功效。楊天睿等[11]證實龍血竭可抑制多種自由基產(chǎn)生，降低氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)心肌細(xì)胞。

UC可發(fā)生癌變，其相關(guān)結(jié)腸癌(CAC)發(fā)病率較散發(fā)性結(jié)腸癌高。VEGF在UC炎性組織中高表達(dá)，進(jìn)而激活血小板形成微血栓，損傷腸黏膜微循環(huán)，加劇缺氧，形成利于CAC形成的微環(huán)境，同時可激活A(yù)GE-RAGE信號通路[12]，進(jìn)而誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)及MAPK、NF-κB等多個信號通路。MAPK信號通路能通過級聯(lián)反應(yīng)來調(diào)控UC中炎癥因子。磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(PI3K-Akt-mTOR)信號通路可通過影響細(xì)胞生長，促進(jìn)UC炎癥及癌變進(jìn)展；EGFR在UC中高表達(dá)，參與UC復(fù)發(fā)、癌變過程[13]；TNF-α可通過NF-κB信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡參與免疫調(diào)節(jié)。

在UC進(jìn)程中，炎性反應(yīng)主要由NF-κB、Jak-STAT、MAPK、TLR等信號通路介導(dǎo)[14]。此外，PTGS2可調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附性及凋亡。氨基末端激酶(C-jun)作為JUN家族中重要一員，其參與炎癥細(xì)胞整個生成及分化過程，通過JUN蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)其功能，有研究表明JUN在UC的發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用[15]。MMP-9可提高炎癥細(xì)胞穿透性，削弱結(jié)腸黏膜防御力；TNF受體阻斷劑可有效抑制促炎因子引起的腸道損傷；Akt主要通過調(diào)控細(xì)胞因子、抑制炎性反應(yīng)介導(dǎo)UC進(jìn)程；IL-2在UC中過表達(dá)[16]，可通過Jak-STAT信號通路干預(yù)炎癥進(jìn)展[17]； TLR通過啟動NF-κB刺激大量炎癥因子釋放[18]。此外還有輔助性T淋巴細(xì)胞1(Th1)和Th2細(xì)胞分化、炎癥性腸病等信號通路均在UC進(jìn)程中起重要作用。

UC的發(fā)病機(jī)制還與氧化應(yīng)激有關(guān)[19-20]。腸道內(nèi)有豐富的微生物群，對氧化應(yīng)激較為敏感，生理狀態(tài)下氧化與抗氧化處于相對平衡狀態(tài)，在某些病理狀態(tài)下致前者超過后者引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，引發(fā)UC。故抑制炎性反應(yīng)，提高活性氧代謝，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)成為治療UC的重要方案。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的結(jié)果顯示，白竭散可通過白及多糖、黃酮類及酚類等成分，調(diào)控Akt1、VEGFA、IL-2、PTGS2、JUN、EGFR、MMP-9、TNF等蛋白表達(dá)，干預(yù)癌癥信號通路、PI3K-Akt、AGE-RAGE、MAPK、NF-κB、Jak-STAT、TNF、TLR等信號通路，以抑制炎性反應(yīng)、提高活性氧代謝、抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來緩解UC腸黏膜損傷，與上述理論不謀而合。

綜上所述，白竭散灌腸可有效緩解UC大鼠腸黏膜損傷，其機(jī)制可能是通過白及多糖、黃酮類及酚類等成分調(diào)控相關(guān)基因和通路，抑制炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng),提高活性氧代謝,從而緩解UC腸黏膜損傷，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點、多通路的作用特點。