基于網絡藥理學研究荷葉堿對多囊卵巢綜合征的作用機制※

張靖悅 趙恒俠 陳宇陽 連李榮

(廣州中醫藥大學第四臨床醫學院2019級碩士研究生，廣東 深圳 518033)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是育齡期女性常見的以高雄激素及持續無排卵或排卵障礙為特征的內分泌代謝異常的疾病，長期可導致生殖功能障礙，增加子宮內膜癌、心腦血管等疾病發病風險[1]。目前，PCOS發病機制尚不明確，胰島素抵抗、低度炎性反應等與PCOS的發生相關[2]。西醫治療PCOS常對癥予促排卵、調節月經周期、增加胰島素敏感性等，但效果一般且有毒副作用[3]。

中藥具有多成分、多靶點的特點，防治PCOS有一定優勢。趙恒俠教授認為，痰濁阻滯為PCOS發病的主要病機，以輕清荷葉為君藥，自擬“荷芪散(主要藥物：荷葉、黃芪、蒼術、香附、郁金、決明子等)”健脾除濕、升清降濁治療PCOS。前期實驗及臨床觀察證實，荷芪散具有改善PCOS大鼠及PCOS患者胰島素抵抗、糖脂代謝，糾正性激素紊亂等作用，但缺少方中中藥單體作用機制的研究[4-6]。

荷葉的有效成分主要包括生物堿類及黃酮類等[7-8]，其中荷葉堿為荷葉中富含的一種異喹啉類生物堿，是荷葉發揮藥理作用的重要成分。目前研究證明，荷葉堿可減輕體質量，改善胰島素抵抗[9]，減緩炎性反應[10]，因此推測荷葉堿可通過提高胰島素敏感性及干預炎性反應起到治療PCOS的作用。但荷葉堿作用靶點及通路眾多，傳統藥理學研究思維方法單一，難以進行全面系統的分析。網絡藥理學以生物信息學、藥理學、生物學等學科為基礎，通過建立“成分-靶點-疾病”模型，全面、系統、多維度分析藥物作用的潛在分子機制，現已被廣泛應用[11]。本研究采用網絡藥理學研究荷葉堿對PCOS的作用靶點及通路，為后續研究提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 荷葉堿結構及作用靶點獲取 ①利用Pubchem數據庫(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)以“Nuciferin“為關鍵詞檢索獲取荷葉堿的3D結構，導入Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch)得到荷葉堿的相關靶點；②利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)以“Nuciferin”為關鍵詞，檢索項為“Chemical Name”進行檢索，獲取荷葉堿的靶點。將上述2個來源的靶點匯總去重后得到荷葉堿的相關靶點，利用Uniprot數據庫(http://www.uniprot.org)將靶點名稱進行基因標準化。

1.2 PCOS疾病靶點獲取 在GeenCard數據庫(The Human Gene Database，http://www.genecards.org)、OMMI數據庫(http://www.omim.org)輸入“polycystic ovary syndrome”檢索，獲得PCOS的疾病相關靶點，匯總去重后利用Uniprot數據庫規范靶點。

1.3 成分-疾病共同靶點篩選 借助Venny 2.1.0(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)在線工具將1.1項中獲得的荷葉堿相關靶點與1.2項中獲得的PCOS疾病靶點進行比對，取交集，并借助Venny 2.1.0在線工具繪制Venn圖，利用Cytoscape軟件建立“成分-靶點-疾病”網絡圖。

1.4 荷葉堿治療PCOS靶點網絡構建 將1.3項中獲得的荷葉堿與PCOS疾病共同靶點基因輸入STRING數據庫，選擇物種為“Homo sapiens”，隱藏游離位點，其余默認選項，構建蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡，并用Cytoscape 3.8.1的Network Analyzer功能分析其網絡拓撲參數，得到主要靶點并可視化。運用R語言軟件繪制度(Degree)值前30位靶點(即核心靶點)的柱狀圖。

1.5 基因本體(gene ontology，GO) 功能富集分析及京都基因與基因組百科全書(kyotoencyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析 利用R軟件的ClusterProfiler包將荷葉堿與PCOS的共同靶點進行GO功能富集分析以描述基因靶點的功能，包括生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞組成(cellular component，CC)，并對交集基因進行KEGG通路富集分析以探討荷葉堿作用的信號通路。GO功能富集分析和KEGG通路富集分析均以P<0.05表示差異有統計學意義，并用微生信平臺繪制條形圖，根據富集分析結果進一步探究荷葉堿治療PCOS的分子機制。

1.6 成分-靶點分子對接 通過TCMSP下載荷葉堿結構的mol2格式文件，使用AutoDock對其進行加氫、加電子等修飾操作，以pdbqt文件格式輸出，利用PDB數據庫(http://www.rcsb.org)獲取核心靶點蛋白3D結構的pdb格式文件，使用AutoDock軟件去水、加氫、加電子后輸出pdbqt格式文件，最后使用AutoDock對以上蛋白進行分子對接并獲得相應結合能(binding energy，BE)，并利用Pymol軟件將結果進行可視化。通過BE評價靶點與蛋白之間的結合活性，BE越低，結合活性越大，發生作用可能性越大。

2 結果

2.1 靶點獲取結果 通過Swiss Target Prediction數據庫及TCMSP數據庫檢索荷葉堿有效靶點，匯總去重后共得到83個靶點，利用GeenCard數據庫和OMMI數據庫檢索PCOS疾病靶點，匯總去重后共得到2575個靶點。

2.2 成分-疾病共同靶點篩選結果 將2.1項中獲得的荷葉堿靶點與PCOS疾病靶點比對取交集后得到交集靶點36個，推測這些靶點可能是荷葉堿治療PCOS的潛在靶點，見表1、圖1；“成分-靶點-疾病”網絡圖，見圖2。

表1 荷葉堿治療PCOS潛在靶點

圖1 荷葉堿-PCOS交集靶點Venn圖

圖2 “成分-靶點-疾病”網絡圖

2.3 荷葉堿治療PCOS靶點網絡構建結果 將交集靶點輸入STRING數據庫構建PPI網絡，并利用Cytoscape 3.8.1可視化，生成荷葉堿治療PCOS靶點PPI網絡圖，見圖3。PPI網絡中除去游離靶點DDP4、NR4A1、FDFT1，共得到33個節點，146條邊，其中節點圖標越大，顏色越深接近墨綠色則在網絡中作用越大，邊越粗表明相互作用關系越強。網絡拓撲分析示，網絡平均度值為8.11，度值越高，表明越傾向為關鍵蛋白，度值排名前30的靶點繪制核心靶點基因條形圖(見圖4)，推測SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3為荷葉堿治療PCOS的核心靶點。

圖3 荷葉堿治療PCOS靶點PPI網絡圖

圖4 核心靶點基因度值條形圖

2.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析結果 GO功能富集分析共獲得1230個條目，其中MF 77個，包括DNA結合轉錄因子結合、核受體活性、蛋白激酶活性、氧化還原酶活性、泛素蛋白連接酶結合、核受體結合、整合素結合等；BP 1115個，包括對激素的反應、對無機物的反應、對凋亡信號通路的調控、對缺氧的反應等；CC 38個，包括質膜蛋白復合物、轉錄調節復合體、髓鞘、囊泡腔、線粒體外膜、質膜外側等，按照-lgP值由大到小排序，對排名前10位的條目進行展示，見圖5。KEGG通路富集分析共得到149條通路(P<0.05)，涉及神經活性配體-受體相互作用(Neuroactive ligand-receptor interaction)、5-羥色胺能突觸(Serotonergic synapse)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、多巴胺能突觸(Dopaminergic synapse)、cAMP信號通路(cAMP signaling pathway)，按-lgP值由大到小排序，對排名前20的通路進行展示，見圖6。

圖5 GO功能富集分析條形圖

圖6 KEGG通路富集分析條形圖

2.5 成分-靶點分子對接結果 將荷葉堿活性成分與SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3 5個核心靶點進行分子對接，見表2、圖7。結果顯示，荷葉堿與上述5種核心靶點蛋白均能良好結合。

表2 核心靶點與荷葉堿分子對接結果

圖7 SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3與荷葉堿分子對接圖

3 討論

本研究基于網絡藥理的方法，對荷葉堿治療PCOS進行系統全面的研究。結果顯示，荷葉堿治療PCOS的潛在靶點有36個，SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3為荷葉堿治療PCOS的核心靶點，可能通過5-羥色胺能突觸、多巴胺能突觸等發揮作用。分子對接研究結果表明，荷葉堿與SLC6A4、DRD2、MAOA、OPRM1、SLC6A3靶點的BE均小于-5 kcal/mol，均可生成氫鍵，說明其與潛在靶點的結合性較高，因此推測，荷葉堿未來可能成為治療PCOS的有效化合物之一，可為新藥的研發提供新思路。

5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是單胺類化合物，又稱血清素，主要由腸嗜鉻細胞合成，作為一種抑制性神經遞質，廣泛存在于大腦皮層及神經突觸內[12]。隨著研究的不斷進展，發現5-HT在中樞神經系統之外的許多系統如內分泌代謝系統等皆發揮著重要作用[12]。視前區(POA)和內側基底下丘腦(MBH)控制排卵期前黃體生成激素(LH)和排卵數量的增加，而POA和MBA受來自腦干下部5-HT分泌的影響[13]。Maekawa F等[14]研究表明，位于腦干的中縫背核在誘導LH峰和排卵中起重要作用，5-HT受體系統參與了這一機制。唐怡等[15]和王建紅等[16]研究表明，慢性刺激使5-HT含量下降，雌性鼠的促性腺激素釋放激素(GnRH)含量亦下降。因此，5-HT與性激素分泌及女性排卵有一定相關性。

多巴胺(DA)系統是維持GnRH和LH基礎分泌的重要因素。現有研究認為，可能由于體內類固醇激素水平的不同，DA對GnRH的釋放有雙向調控作用，即雌激素水平高時抑制GnRH的分泌，雌激素水平低時促進GnRH的分泌。PCOS患者表現為高雄激素血癥，較高水平的雄激素在芳香化酶的作用下轉化為較多的雌二醇和雌酮，因此多數研究認為，DA對PCOS患者GnRH有較強的抑制作用。國內外許多研究表明，PCOS患者表現為中樞性DA減少，從而引起LH異常分泌[18-19]。此外，PCOS患者多合并肥胖，而5-HT和DA神經遞質系統可通過調節食欲改善肥胖[20]。5-HT影響肝臟局部的脂質儲存，而不影響全身能量平衡[21]。5-HT還被發現通過HTR2A在脂肪組織中誘導脂肪生成[22]。DA作用的發揮很大程度上受3種酶COMT、MAOA和MAOB以及SLC6A3控制[23]。其中，MAOA還有平衡大腦中5-HT分泌的作用[24]。Need A C等[23]在一項研究對象均為女性的研究中發現，MAOA基因型與體質量和體質量指數(BMI)均顯著相關，MAOA在肥胖者中表現為過量的低活性基因型。DRD2多態性亦與體質量相關[25]。

OPRM1是阿片類受體，廣泛存在于大腦和機體的其他外周組織中。內源性阿片肽作為下丘腦GnRH分泌的抑制性調節劑，對卵巢功能有著重要的影響[26]。阿片類藥物活性升高在高雄激素血癥、高胰島素血癥的發病機制中起關鍵作用，長期阿片受體阻斷治療可以使高雄激素血癥婦女的高胰島素血癥恢復正常[27]。內源性阿片類受體參與改善運動誘導的胰島素抵抗，外周阿片類受體激活有助于改善受損的受體后胰島素信號通路[28]。因此，推測OPRM1可以改善PCOS患者高雄激素血癥以及胰島素抵抗狀態。

綜上，本研究通過網絡藥理學的方法證實了荷葉堿通過多靶點、多通路治療PCOS，對實驗結果預測的核心靶點與荷葉堿進行分子對接均有良好的結合活性，結果與現有文獻報道相吻合。進一步證明了網絡藥理學的可靠性，為進一步實驗和臨床研究提供了理論參考依據。但網絡藥理學可能存在疾病、藥物靶點數據庫信息不全等不足，因此仍需進一步開發健全完善精度更高的中藥挖掘技術。