三陰性乳腺癌患者血清中miRNA-21、miRNA-210表達及其臨床意義

趙霞

（河南中醫藥大學第三附屬醫院，河南鄭州 450004）

乳腺癌為全球范圍內女性常見的惡性腫瘤，約占所有女性惡性腫瘤的22%，每年全球有50 余萬女性死于乳腺癌［1］。三陰性乳腺癌為特殊亞型乳腺癌類型，是指孕激素受體（PR）、雌激素受體（ER）及人表皮生長因子受體2（HER-2）均為陰性的乳腺癌類型，常發于年輕女性，大部分均屬基底細胞樣乳腺癌，細胞同源性高，組織分化程度差，對內分泌及分子靶向治療不敏感，預后差，病死率高［2］。在分子及遺傳學方面，惡性腫瘤系基因表達調節失衡的結果，其病變過程包括抑癌基因失活及原癌基因激活，而明確三陰性乳腺癌腫瘤細胞異常表達基因，并阻斷靶基因表達，則可為其靶向治療提供指導。miRNA 為真核細胞內分布的微小內源性非編碼單鏈RNA 分子。研究發現，miRNA 對多類腫瘤相關基因表達均存在一定的負調節作用，在惡性腫瘤發病及進展中有重要作用［3］。miRNA-21 是目前研究較多的與腫瘤發生相關的miRNA，在胃癌、肺癌中均可見miRNA-21高表達［4-5］，且體外試驗證實，miRNA-21 與癌細胞生長及凋亡均存在密切聯系［6］。miRNA-210 則為與食管癌、尿路上皮細胞癌發病密切相關癌基因，位于染色體11p15.5 上，可降低DNA 的修復能力，促進腫瘤新生血管生成［7］。但對miRNA-21、miRNA-210 與三陰性乳腺癌發病的關系尚未明確。基于此，為明確miRNA-21、miRNA-210 在三陰性乳腺癌患者血清中的表達及其臨床意義，現對河南中醫藥大學第三附屬醫院收治的64 例三陰性乳腺癌患者的臨床資料進行回顧性分析，報道如下。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

收集2015 年5 月至2017 年7 月河南中醫藥大學第三附屬醫院收治的64 例三陰性乳腺癌患者作為病例組。納入標準：經病理確診為三陰性乳腺癌，且符合國際抗癌聯盟（UICC）相關分期標準，為Ⅰ～Ⅳ期患者；年齡>18 歲；入組前均未接受任何治療；病例及隨訪資料完整。排除標準：入院3 個月內有激素依賴史者；合并其他惡性腫瘤者；合并心、肝、腎肺器質性功能障礙者；合并嚴重精神疾病者；合并自身免疫性疾病者；合并全身代謝紊亂者；采集血樣前已接受放化療或靶向治療者；妊娠或哺乳期女性；病例資料不完整者。患者年齡22～73 歲，平均（42.6±5.7）歲；月經狀況：絕經前43 例，絕經后21 例；臨床分期：Ⅰ期4 例，Ⅱ期26 例，Ⅲ期24 例，Ⅳ期10例。選擇同期來醫院體檢的40 例正常健康女性作為對照組，均經體格檢查心肝腎肺功能正常，無乳腺癌家族病史。對照組年齡21～69 歲，平均（41.9±6.3）歲；月經狀況：絕經前27 例，絕經后13 例。

1.2 主要材料與儀器

RNA 抽提試劑盒、實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）試劑盒、miRNA cDNA 合成試劑盒（均購自美國Invitrogen 公司），Takara 反轉錄試劑盒（購自大連寶生物工程公司），引物設計及合成（上海生工生物工程股份有限公司）；7900HT 型熒光定量PCR 儀（購自美國ABI 公司），Allegra X-15R高速冷凍離心機（購自美國Beckman Coulter 公司），-80℃超低溫冰箱（購自中國海爾電器公司），紫外分光光度計（購自德國Eppendorf 公司），倒置顯微鏡（購自日本Olympus 公司）。

1.3 方法

①血清miRNA-21、miRNA-210 測定。病例組入院次日采集外周空腹靜脈血6 mL，對照組體檢當日采集空腹靜脈血6 mL，室溫靜置，3 500 r/min離心10 min 后分離血清，嚴格參照RNA 抽提試劑盒使用說明提取血清總RNA，反轉錄合成cDNA，反轉錄反應體系：RNA 模板1 μL+5×RT 緩沖液5 μL+dNTP 0.75 μL+RNA 酶抑制劑0.25 μL+反轉錄酶0.25 μL+去離子水補足至20 μL，反轉錄條件：16℃30 min，42℃30 min，75℃15 min，獲得cDNA 產物；采用RT-PCR 法測定miRNA-21、miRNA-210 表達量，應用RT-PCR 試劑盒進行擴增反應，U6 為內參，上游引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGCAT-3'，下游：5'-GGGTGGAATACATTGGAACATGT-3'；miRNA-21上游：5'-GTGCAAGCGAAATTAAGGGA-3'，下游：5'-CTGCACCACCTTTCTTTGGT-3'；miRNA-210 上游：5'-ATTATACAATAG-TGCAGGGTCCGAGGTATT-3'，下游；5'-TAAAATATTACTGTGCGTGTGACAGC GG-3'；反應體系：cDNA 產物2 μL+miRNA qPCR Mix 10 μL+miRNA-21/miRNA-210 上下游引物各1 μL+雙蒸水補足至20 μL，擴增條件：95℃預變性60 s，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸40 s，共50 個循環，均設2 復孔，獲得樣品RT-PCR 曲線，獲取目的基因循環閾值（Ct 值），血清miRNA-21、miRNA-210 相對表達量參照2-△△Ct進行計算。②臨床病理資料收集。均收集所有病例組患者臨床病理資料，包括年齡、絕經狀況、腫瘤直徑、病理分化程度、腫瘤分期、淋巴結轉移等，分析血清miRNA-21、miRNA-210 與三陰性乳腺癌臨床病理參數的關系。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件處理數據，計量數據以均數±標準差（）表示，組間比較進行t檢驗，并以多重線性回歸分析miRNA-21、miRNA-210 與三陰性乳腺癌臨床病理的關系，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病例組、對照組血清miRNA-21、miRNA-210 表達比較

病例組血清miRNA-21、miRNA-210 相對表達量均高于對照組，組間比較差異具有統計學意義（P<0.05），見表1 與圖1、2。

2.2 三陰性乳腺癌血清miRNA-21、miRNA-210表達與臨床病理參數的關系

不同年齡、絕經狀態、腫瘤直徑三陰性乳腺癌患者miRNA-21、miRNA-210 相對表達量比較差異無統計學意義（P>0.05），臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、組織分化程度為低分化、合并淋巴結轉移的三陰性乳腺癌患者血清miRNA-21、miRNA-210 相對表達量高于臨床分期為Ⅰ～Ⅱ期、組織分化程度為中高分化及未合并淋巴結轉移者，比較差異有統計學意義（P<0.05），見表2。

表1 病例組、對照組血清miRNA-21、miRNA-210 表達比較 （）

表1 病例組、對照組血清miRNA-21、miRNA-210 表達比較 （）

圖1 兩組miRNA-21 表達量比較

圖2 兩組miRNA-210 表達量比較

表2 三陰性乳腺癌血清miRNA-21、miRNA-210 表達與臨床病理參數的關系 （）

表2 三陰性乳腺癌血清miRNA-21、miRNA-210 表達與臨床病理參數的關系 （）

2.3 miRNA-21、miRNA-210 與臨床病理參數關系多元逐步回歸分析

納入單因素分析中有統計學意義數據進入多元逐步回歸分析方程，結果顯示：miRNA-21、miRNA-210 均為三陰性乳腺癌患者臨床分期、組織分化程度、淋巴結轉移的影響因素（P<0.05），見表3。

表3 miRNA-21、miRNA-210 與臨床病理參數關系多元逐步回歸分析

3 討論

miRNA 為一類內源性、微小型非編碼單鏈RNA 分子，調節多種生物學信號通路，可與靶基因互補點位配對結合，影響靶基因轉錄，影響miRNA 降解及蛋白質合成［8］。近期研究發現，miRNA 異常表達可能參與任一惡性腫瘤形成過程，包括結腸癌、食管癌、肺癌等［9-10］，低表達miRNA 可能存在一定的抑癌基因作用，而高表達miRNA 則存在癌基因作用，體內miRNA 調節紊亂可能是惡性腫瘤發生的重要機制。三陰性乳腺癌為特殊亞型乳腺癌，發病年齡年輕，且惡性程度高，組織分化程度低，大部分臨床分期較晚，常伴腋窩淋巴結轉移，較一般亞型乳腺癌侵襲性高，病情進展速度快，復發及遠處轉移率明顯高于其他類型乳腺癌［11］。且對化療、內分泌治療及靶向治療敏感度低，預后差。目前尚未完全明確三陰性乳腺癌發病的機制，隨著醫學分子生物技術的不斷發展，研究者逐漸認識到miRNA 在乳腺癌發病中可能存在一定的調控作用［12］。

miRNA-21 定位于17q23.2，位于液泡膜蛋白基因編碼區，文獻報道，宮頸癌、大腸癌、胰腺癌等多種腫瘤標本及細胞系內均可檢出miRNA-21異常高表達，認為miRNA-21 為公認致癌性miRNA，其過度表達可促進腫瘤新生血管生成［13-14］。楊晨等［15］指出，miRNA-21 在腫瘤化療藥物敏感性存在一定的調節作用。細胞藥物敏感性試驗發現，miRNA-21 表達水平上升可影響抗癌復合物效能［16］。也有學者發現，miRNA-21 表達與惡性腫瘤侵襲性有關，隨腫瘤惡性程度的上升，miRNA-21 表達水平上調［17］。本研究采用RT-PCR法測定三陰性乳腺癌與正常健康人血清miRNA-21水平，結果發現，病例組miRNA-21 水平明顯高于正常健康人，提示miRNA-21 異常表達可能參與三陰性乳腺癌的發病過程。同時，對miRNA-21 與三陰性乳腺癌臨床病理參數的關系進行研究發現，臨床分期越晚、組織學分級越低且伴淋巴結轉移的三陰性乳腺癌患者血清miRNA-21 相對表達量越高，提示miRNA-21 異常表達與三陰性乳腺癌生物學行為存在密切聯系，高表達miRNA-21 可能參與三陰性乳腺癌癌細胞侵襲、轉移過程，且與患者病情進展存在緊密關聯。

miRNA-210 則為近年來發現與腫瘤細胞增殖、遷移有關的miRNA，其為細胞缺氧應答的關鍵分子，參與血管內皮生長因子所介導的細胞侵襲、轉移過程［18］。研究發現，miRNA-210 參與乏氧細胞生物學功能調節，持續高表達miRNA-210 可調節缺氧條件下癌細胞線粒體功能，促進乏氧癌細胞生長［19］。ZHU 等［20］表示，miRNA-210 可通過調節纖維母細胞生長因子受體促進腫瘤細胞增殖。也有學者發現，在肝癌細胞內高表達miRNA-210可通過靶向定位乙型肝炎病毒基因促使病毒復制，造成持續性感染［21］。張雙鶴等［22］指出，乳腺癌細胞株miRNA-210 過表達與癌細胞乏氧分數有關，miRNA-210 高表達乳腺癌患者預后通常較差。本研究發現，三陰性乳腺癌患者血清miRNA-210 相對表達量明顯高于正常健康人，且進行病理參數監測發現，miRNA-210 表達受三陰性乳腺癌病理分期、組織分化程度及淋巴結轉移的影響，提示miRNA-210 在三陰性乳腺癌血管形成、癌細胞存活、DNA 修復等過程均發揮一定的作用，同時可誘導乳腺癌細胞侵襲、轉移，可將其作為三陰性乳腺癌治療的新靶點。

綜上所述，三陰性乳腺癌患者血清miRNA-21、miRNA-210 相對表達量明顯高于正常健康人，且其表達量受三陰性乳腺癌臨床分期、組織學分級及淋巴結轉移的影響，臨床分期越晚、組織分化程度越低且伴淋巴結轉移的三陰性乳腺癌患者血清miRNA-21、miRNA-210 表達水平越高。