鎂合金生物材料的生物相容性研究

張聰正 梁晨 梁婷 孫雪函 郝書鵬

摘要：目的 評價羥基磷灰石（HA）涂層鎂鋁合金（AZ31B）的體外生物相容性。 方法 實驗分為3組：HA涂層AZ31B浸提液組（H組）、陽性對照組（P組）和空白對照組（N組）。將L929細胞與各組混合液培養3、5和7 d，采用WST-1法檢測細胞活力并進行細胞毒性分級。各組混合液與稀釋兔血混勻，測定吸光度（OD）并計算溶血率。采用各組混合液對白化豚鼠分別進行皮內誘導、局部誘導和激發，觀察去除貼敷片24、48、72 h動物激發部位皮膚情況。 結果 3、5和7 d N組和H組細胞毒性反應分級為0級，P組部分細胞毒性反應分級為3級;各時間點 H 組、N 組細胞活力均高于 P 組，差異有統計學意義（P <0.05）。H 組、P 組和 N 組 OD 值分別為（0.004 ±0.001）、（0.648 ± 0.050）和（0.008 ± 0.003）;H組溶血率為—0.6%，無溶血反應。去除貼敷片24、48、72 h H組皮膚無明顯改變，P組可見中度至重度融合性紅斑。 結論 體外實驗提示HA涂層鎂鋁合金具有良好的體外生物相容性。

關鍵詞：鎂;鋁;合金;羥基磷灰石類;骨代用品;生物相容性材料;組織相容性實驗

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑和材料

酶標儀（澳大利亞，Biocell公司），Du530分光光度計（美國，Beckman 公司）;CO2培養箱（美國，Thermo Scientific公司）;高糖DMEM培養液、優等胎牛血清、胰蛋白酶（美國，Hyclone公司），WST-1（上海碧云天生物技術有限公司），草酸鉀（廣州化學試劑廠），二甲基亞砜（DMSO）、完全氟氏佐劑（美國，Sigma 公司）;HA 涂層鎂鋁合金（AZ31B）。

圓盤型樣品，直徑10 mm、厚3 mm（中國科學院金屬所提供）;小鼠成纖維細胞L929（廣州軍區廣州總醫院醫學實驗科細胞庫提供）。

1.2 實驗動物

新鮮抗凝兔血取自新西蘭大白兔[廣東省醫學實驗動物中心提供，SCXK（粵）2008-0002]，白化豚鼠購自廣東省實驗動物中心[SCXK（粵）2008-0002]。

1.3 細胞毒性實驗

分別于培養3、5、7 d取各組6孔觀察細胞形態，按細胞毒性反應分級標準判定毒性分級。培養板內每孔加入10 μL WST-1溶液后置于搖床上搖動 1 min，37 ℃培養箱內繼續孵育2 h。采用酶標儀在420和620 nm下測量吸光度（optical density，OD）值，檢測細胞活力。

1.4 溶血實驗

實驗分為 HA 涂層 AZ31B 浸提液實驗組（H組）、蒸餾水陽性對照組（P組）以及生理鹽水陰性對照組（N組）。各組平行操作3個樣本。其中H組將 HA 涂層 AZ31B 樣品完全浸泡于生理鹽水（濃度為0.9%）中，37 ℃恒慍水浴保持30 min。取0.1 mL草酸鉀溶液（濃度為20 g/L）加入干燥管中。取新西蘭白大白兔血2 mL加入干燥管，2.5 mL生理鹽水（濃度為0.9%）稀釋。AZ31B浸提液、蒸餾水、生理鹽水（各 2 mL）中分別加入 0.02 mL 稀釋兔血，混勻后37℃水浴繼續保溫60 min，取出后以 1 000 r/min 離心 5 min。比色皿中移入各組上清液，分光光度計于545 nm波長處測定OD值。

實驗樣品溶血率按以下公式計算：實驗樣品溶血率 =（實驗組OD值—陰性對照組OD值）（陽/性對照組OD值—陰性對照組OD值）。陰性對照組的OD值不應大于0.03，陽性對照組的OD值應在0.5～1.0之間。

1.5 統計學分析

應用 SPSS 18.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（x- ± s）表示，多組細胞毒性實驗OD 值的比較采用Factorial ANOVA分析，組間兩兩比較采用 S-N-K 法;多組溶血試驗 OD 值的比較采用One-way ANOVA。P <0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 細胞毒性實驗

培養3、5、7 d N組和H組細胞貼壁生長良好，無細胞懸浮，毒性反應分級為0級;P組部分細胞呈懸浮狀態，細胞量較少，毒性反應分級為3級。N組和H組培養3 d細胞密度較低，細胞伸展良好，呈長梭形或多邊形;培養5 d細胞密度增加，細胞間較為擁擠，絕大部分細胞伸展良好，呈長梭形或多邊形，部分細胞因細胞密度增加而形成圓形;培養7 d細胞密度極高，細胞間極其擁擠，出現分層現象，細胞難以伸展，細胞形態變小，出現大量圓形細胞。

H組和N組各觀察期OD值均較P組為高，差異有統計學意義（P <0.05）;H組和N組隨時間推移細胞活力逐漸增大，5 d時達到最高峰后開始下降（P <0.05）。

2.2 溶血試驗

N 組、P 組平均 OD 值分別為（0.008 ± 0.003）和（0.648 ± 0.050），本組實驗有效;H組溶血率為—0.6%，無溶血反應。

3 討論

鎂合金具有與人體相匹配的力學特性，以及其它金屬所不具有的可降解性，可望成為一種新型骨科植入材料。我們既往的實驗研究結果證實，無涂層鎂鋁合金具有嚴重的溶血反應，本實驗結果顯示HA涂層鎂鋁合金溶血率為—0.6%，無溶血反應。

孟祥翔等報道，表面進行階躍式陽極氧化改性后的鎂合金 （AZ-1 和 AZ-3）材料溶血率<5%，具有良好的血液相容性;郭磊等對氧化鎂表面膜處理的AZ31B鎂合金材料進行安全性評價，結果顯示，與AZ31B鎂材料較高的溶血率相比，經氧化鎂表面膜處理的AZ31B鎂合金材料其溶血率符合生物材料標準，表明涂層處理可大大減少鎂合金的溶血作用。

盡管我們的既往研究提示鎂鋁合金無皮膚致敏作用，但畢竟涂層改變了鎂鋁合金的性狀，因此我們對HA涂層鎂鋁合金作了進一步的皮膚致敏實驗，結果顯示豚鼠皮膚無明顯改變，該涂層材料無致敏作用。

參考文獻：

[1] 劉魁， 郭磊， 黃晶晶， 等. AZ31B鎂合金植入小鼠的生物相容性考察[J] . 中國生物工程雜志， 2008， 28（3）： 59-63.

[2] 陳旭瓊， 尹慶水， 張余， 等. 鎂合金材料的溶血率及影響因素[J] . 中國組織工程研究， 2012， 16（25）： 4632-4636.

課題項目：

1、河南省科技攻關項目，項目編號：192102210162;

2、河南省高等學校重點科研項目，項目編號：21A4300 28。