人外周血單個核細胞的采集、分離和保存

·中國醫藥生物技術協會團體標準·

人外周血單個核細胞的采集、分離和保存

目 次

前言……………………………………………………………………………………………………………… 87

1 范圍…………………………………………………………………………………………………………… 88

2 規范性引用文件……………………………………………………………………………………………… 88

3 術語和定義…………………………………………………………………………………………………… 88

4 總則…………………………………………………………………………………………………………… 89

5 實驗原理……………………………………………………………………………………………………… 89

6 實驗方法……………………………………………………………………………………………………… 89

7 質量控制……………………………………………………………………………………………………… 92

參考文獻………………………………………………………………………………………………………… 93

前 言

本文件按 GB/T 1.1-2020 給出的規則起草。

本文件由中國醫藥生物技術協會歸口。

本文件起草單位：中國醫藥生物技術協會組織生物樣本庫分會、生物芯片上海國家工程研究中心、上海芯超生物科技有限公司、廣州中醫藥大學第二附屬醫院（廣東省中醫院）。

本文件主要起草人：郜恒駿、沈曉瑩、杜莉利、亓垚、張小燕、許靖曼、陳明敏、陳曲波、葉揚、李迪。

人外周血單個核細胞的采集、分離和保存

1 范圍

本文件規定了采集、分離和保存人外周血單個核細胞的實驗原理、實驗方法和質量控制。

本文件適用于科研用人外周血單個核細胞的采集、分離和保存，若用于臨床，應按照臨床相關要求進行操作。

2 規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T 38576-2020 人類血液樣本采集與處理

3 術語和定義

以下術語和定義適用于本文件。

3.1

外周血單個核細胞 peripheral blood mononuclear cell, PBMC

外周血中具有單個核的細胞，包含淋巴細胞、單核細胞、樹突狀細胞和其他少量細胞（造血干細胞等）。

3.2

淋巴細胞分離液 lymphocyte separation medium

一種密度介于1.075 ~ 1.090 g/ml 之間而近似于等滲的溶液，用它做密度梯度離心，使一定密度的細胞按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。

3.3

RPMI-1640 培養基 RPMI-1640 medium

洛斯維?帕克紀念研究所（Roswell Park Memorial Institute，RPMI）研發的一類細胞培養基，1640 是培養基代號。

3.4

二甲基亞砜 dimethyl sulfoxide, DMSO

非質子極性溶劑，常用于化學反應、PCR 反應以及在細胞、組織和器官的保存中用作玻璃化低溫冷凍防護劑。DMSO 用于細胞冷凍培養基內，可以保護細胞免受冰晶引起的機械性損傷。它也可以用于主培養、亞培養、重組異倍體、雜交瘤等系列細胞株，胚胎干細胞（ESC）和造血干細胞的冷凍保藏。另外常常與BSA 或FBS 混合使用。

3.5

臺盼藍 trypan blue

也稱臺盼蘭、錐蟲藍、曲利苯藍，細胞活性染料，常用于檢測細胞膜的完整性，檢測細胞是否存活。活細胞不會被染成藍色，而死細胞會被染成淡藍色。臺盼藍可被巨噬細胞吞噬，故可用于巨噬細胞的活體染色劑。

3.6

知情同意 informed consent

供體對生物樣本（本文件中為“外周血”）捐贈的目的和研究用途等明了和認可。以生物樣本供體自愿同意參與為原則，以當事雙方共同簽署知情同意書為具體體現。

3.7

脫氧核糖核酸 deoxyribonucleic acid, DNA

染色體主要組成成分，同時也是主要遺傳物質。

3.8

核糖核酸 ribonucleic acid, RNA

存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。RNA 由核糖核苷酸經磷酸二酯鍵縮合而成的長鏈狀分子。一個核糖核苷酸分子由磷酸、核糖和堿基構成。

4 總則

本文件采用密度梯度離心法進行人 PBMC 的分離，此方法適用范圍廣、性價比高、結果穩定。此外還有加速紅細胞沉降法、塑料吸附法、Colotta 法、分離管法等。這些方法分離的 PBMC 應符合后續實驗要求。

5 實驗原理

外周血各種血細胞的密度不盡相同，利用淋巴細胞分離液作密度梯度離心，使一定密度的細胞群按相應密度梯度分布，從而將各種血細胞加以分離。紅細胞、粒細胞密度大，離心后沉于管底；PBMC 的密度小于或等于分離液，離心后漂浮于分離液的液面上，也有少部分細胞懸浮在分離液中。吸取分離液液面的細胞，就可從外周血中分離到PBMC。

6 實驗方法

6.1 材料

6.1.1 主要設備：生物安全柜、低溫水平式離心機、血球計數板、顯微鏡、血細胞分離機等。

6.1.2 主要耗材：真空采血管（ACD/EDTA/肝素抗凝）、離心管、移液管、無菌吸頭、凍存管、巴氏吸管、移液器、輔助移液器、注射器、無菌棉球、鑷子、橡皮止血帶等。

6.1.3 主要試劑：RPMI-1640 培養基、胎牛血清、DMSO、淋巴細胞分離液（20 ℃時密度為1.077 ±0.001 g/ml）、臺盼藍染色液、碘酒、75% 酒精等。

注：培養基也可用無血清培養基和營養添加物替代。

6.2 步驟

6.2.1 PBMC 的采集

6.2.1.1 獲得供體知情同意后，按照 GB/T 38576-2020 常規無菌抽取新鮮外周血至 ACD/EDTA/肝素抗凝管中。

6.2.1.2 獲得供體知情同意后，使用血細胞分離機，按照操作手冊規范地采集；采集到的血液或細胞在采集、處理和運輸過程中避免冷凍和冷藏，并盡快分離 PBMC。

6.2.2 PBMC 的分離

6.2.2.1 分離前的準備：潔凈實驗室（凈化等級不低于百萬級）的常規消毒，紫外燈照射潔凈間和生物安全柜，且保持臺面的整潔；準備好本次分離所需無菌耗材、RPMI-1640 培養基、胎牛血清、DMSO、淋巴細胞分離液等。淋巴細胞分離液和RPMI-1640 培養基應提前置于室溫。

6.2.2.2 分離PBMC：取出無菌離心管，加入淋巴細胞分離液；同時將所得外周血樣本用生理鹽水/PBS 等體積稀釋，并充分混勻，形成外周血的稀釋液；再將稀釋液加入到淋巴細胞分離液中，應將稀釋液緩慢勻速地加至淋巴細胞分離液面之上，確保血液稀釋液和淋巴細胞分離液形成明顯分層（上層為血液稀釋液，下層為淋巴細胞分離液）。

6.2.2.3 室溫低速離心（500 ×，下同）20 min。

6.2.2.4 離心畢，可見離心管中液體形成明顯分層，從上到下依次為血漿與生理鹽水/PBS 混合液層、單個核細胞白膜層、人淋巴細胞分離液層及紅細胞層。用巴氏管或無菌吸頭小心吸取白膜層，置于新的離心管中，注意不要吸到淋巴細胞分離液；補充適量的細胞培養基或緩沖液，用移液管吹打均勻。

6.2.2.5 室溫低速離心10 min。

6.2.2.6 吸棄上清液，保留細胞沉淀，補充適量的細胞培養基或緩沖液，輕柔且充分吹打均勻后，離心洗滌細胞：4 ℃低速離心5 min。

6.2.2.7 重復步驟6.2.2.6。

6.2.2.8 離心畢，吸棄上清液，進行活細胞計數。

6.2.2.9 將PBMC 按照一定密度種入培養板或培養瓶繼續培養，也可將PBMC 凍存備用。

6.2.3 PBMC 的凍存和復蘇

6.2.3.1 進行活細胞計數，根據計算得到的 PBMC 總數，計算凍存所需管數。

6.2.3.2 取出所需數量凍存管，標記好細胞編號、細胞總數和凍存日期。

6.2.3.3 配制凍存液。

6.2.3.4 在 PBMC 細胞沉淀中加入一定體積配制好的細胞凍存液，輕柔且充分吹打均勻；將吹打均勻的細胞懸液分裝入凍存管中，1 ml 凍存液可用于5 × 105~ 5 × 106個細胞的凍存。

6.2.3.5 常規將細胞程序性降溫。

注：某些細胞凍存液無需程序性降溫。

6.2.3.6 將經過程序性降溫的凍存管轉入液氮容器中，并記錄好細胞凍存管放置的位置。

6.2.3.7 PBMC 復蘇時，提前將復蘇設備預熱至37 ℃，操作人員注意做好防護，迅速從液氮中取出所需管數細胞，將凍存管輕輕放入復蘇設備，使細胞快速融化。

6.2.3.8 在無菌離心管中加入適量的完全培養基，將細胞凍存管中細胞懸液吸出置于離心管中，室溫低速離心10 min，計數，按一定密度接種于培養板或培養瓶。

注：完全培養基指的是90% 培養基+ 10% 胎牛血清。

6.2.4 用于 RNA 抽提的 PBMC 預處理

6.2.4.1 將含有 PBMC 的細胞懸液轉移至離心管，室溫低速離心。

6.2.4.2 離心畢，去掉上清，加入適量 PBS 小心將細胞沉淀吹打均勻，室溫低速離心。

6.2.4.3 重復 6.2.4.2 操作兩次。

6.2.4.4 將細胞重懸浮于RNA 保護液中，轉移至無核酸酶的離心管中。4 ℃可保存1 ~ 3 天，–20 ℃ 可保存30 天左右，如需長期保存，請置于–80 ℃冰箱或液氮罐中。

6.2.4.5 RNA 抽提時，將保存PBMC 的離心管從存儲設備中取出，恢復至室溫后，立即進行RNA抽提。

6.2.5 用于 DNA 或蛋白抽提的 PBMC 預處理

6.2.5.1 將含有 PBMC 的細胞懸液轉移至離心管，室溫低速離心。

6.2.5.2 離心畢，去掉上清，加入適量 PBS 小心將細胞沉淀吹打均勻，室溫低速離心。

6.2.5.3 重復 6.2.5.2 操作一次。

6.2.5.4 加入適量 PBS 緩沖液將細胞沉淀吹打均勻，將細胞懸液轉移至無核酸酶的離心管，室溫低速離心。

6.2.5.5 去掉上清，將細胞沉淀 –80 ℃凍存。

6.2.5.6 DNA 抽提時，將保存PBMC 的離心管從存儲設備中取出，待細胞沉淀融化后，立即進行DNA 抽提。蛋白抽提時，將保存PBMC 的離心管從存儲設備中取出，置于冰上，待細胞沉淀融化后，立即進行蛋白抽提。

7 質量控制

7.1 活細胞計數

7.1.1 總則

選擇合適的活細胞計數法進行計數，常用的有臺盼藍染色等方法。

7.1.2 臺盼藍染色方法

將細胞沉淀用RPMI-1640 培養基補充，充分吹打均勻后，用精確量程的移液器吸取適量細胞懸液，置于EP 管中，隨之在EP 管中加入適量臺盼藍，使其終濃度為0.04%，充分混勻，臺盼藍染色3 min，取適量細胞懸液勻速加入血細胞計數板，倒置相差顯微鏡下計數：分別計數四大格未染成藍色的細胞總數和染成藍色的細胞總數，將結果記錄在專用計數本上。利用如下公式計算分離所得PBMC 總數和存活率：

注：X：細胞總數；Y：四大格染成藍色細胞總數；N：四大格細胞總數；n：細胞懸液稀釋倍數；v：細胞懸液總體積；S：細胞存活率（%）。

7.2 RNA 的質量控制

應對RNA 的濃度、純度與完整性進行質量檢測。

7.2.1 RNA 的濃度可使用分光光度、熒光染料等方法進行檢測。

7.2.2 RNA 的純度可使用分光光度、瓊脂糖凝膠電泳等方法進行檢測。

7.2.3 RNA 的完整性可使用微流控分析、瓊脂糖凝膠電泳等方法進行檢測。

7.3 DNA 的質量控制

應對DNA 的濃度、純度與完整性進行質量檢測。

7.3.1 DNA 的濃度可使用分光光度、熒光染料等方法進行檢測。

7.3.2 DNA 的純度可使用分光光度、瓊脂糖凝膠電泳等方法進行檢測。

7.3.3 DNA 的完整性可使用瓊脂糖凝膠電泳等方法進行檢測。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.016