健康成人糞便中雙歧桿菌的分離鑒定及其發酵乳體內特性研究

張旭東，莊偉清，李忠磊，劉 薔，劉洪岐，陳代杰，邵 雷，譚 俊*

（1.上海醫藥工業研究院，上海 201203；2.上海交通大學 藥學院，上海 200240；3.上海健康醫學院協同科研中心，上海 201318）

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是1899年由法國學者TISSIER從母乳喂養的嬰兒糞便中分離出的一種厭氧的革蘭氏陽性桿菌[1]，被廣泛應用于牛奶、酸乳、嬰兒配方奶粉、谷物類食品、奶酪和膳食補充劑等食品中[2]，其在調節腸道菌群[3]、改善腸道炎癥[4-5]、抗衰老[6]、抗腫瘤[7]和降血脂抗肥胖[8-9]等方面發揮著重要作用。如雙歧桿菌在人體腸道內可產生大量的醋酸，同時生成乳酸和甲酸，造成腸道內的低pH環境，抑制有害菌和致病菌的生長，并促進大腸蠕動，防止下痢和便秘，促進人體代謝機能[10]。

雙歧桿菌是人和動物腸道的優勢菌群，影響著人類胃腸道的健康[11]。雙歧桿菌從出生一次性獲得，并終生攜帶，但隨著年齡增長菌群數量會發生變化，呈先減少后穩定趨勢[12]。成年人腸道內雙歧桿菌數量處于穩定狀態，老人或胃腸道病人的雙歧桿菌水平較低甚至缺乏[13]。通過服用益生菌活菌產品來補充雙歧桿菌數量是一種不錯的選擇，但是雙歧桿菌必須保證一定的攝入量才能在人體腸道中定殖并發揮其功能[14]，有研究報道[15-16]，雙歧桿菌的活菌制劑需要達到一定的活菌數才能發揮益生作用，維持益生功能的最低活菌濃度應不低于107CFU/mL。

本研究為篩選出一株具有潛在益生功能的菌株，采用MRS培養基，結合菌落形態觀察和16S rDNA基因序列同源性分析，從健康的成人糞便中分離雙歧桿菌。通過7 L發酵罐發酵試驗篩選優良菌株，并利用該菌株制備發酵乳，研究其在小鼠體內的特性，為雙歧桿菌產品的開發奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

糞便樣品：采集上海地區健康成人（18～25歲）6人、性別隨機、無腸胃病史、1月內未服用過抗生素藥品、益生菌的新鮮糞便，立即加入裝有無菌水的燒杯中，用無菌紗布封口轉移至超凈工作臺中，備用，室溫放置不超過2 h。

1.1.2 化學試劑

蛋白胨、牛肉粉、酵母粉（均為生化試劑）：安琪酵母股份有限公司；脫脂奶粉：恒天然集團有限公司；氯化鈉、無水乙酸鈉（均為分析純）：連云港冠蘇實業有限公司；氫氧化鈉（分析純）：濟南英出化工科技有限公司；葡萄糖、碳酸鈉（均為分析純）：西王藥業有限公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽（分析純）：河南盛之德商貿有限公司；MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、檸檬酸三銨（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；TB GreenTMPremix ExTaqTMII：日本Takara公司；糞便基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：天根生化科技有限公司。

1.1.3 培養基[17]

MRS培養基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉5.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，吐溫80 1 mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g/L，CH2COONa·3H2O 5.0 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，瓊脂粉15.0 g/L，pH 6.2。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

斜面培養基：蛋白胨3.0 g/L，酵母粉12.5 g/L，葡萄糖6.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，無水乙酸鈉3.0 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.55 g/L，瓊脂粉18.0 g/L，pH 6.8。121 ℃滅菌20 min。

種子培養基：即斜面培養基中不加瓊脂。

發酵培養基：脫脂奶粉80.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，碳酸鈉3.8 g/L，pH 6.8。115 ℃高壓滅菌20 min。

GAM培養基：上海士鋒生物科技有限公司；BBL培養基：杭州百思生物科技有限公司。

1.1.4 實驗動物

健康雄性無特定病原體（specefic pathogen free，SPF）級美國癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠（6～8周齡，質量（18±2）g）：上海杰思捷實驗動物有限公司。實驗小鼠飼養于恒溫恒濕環境中，自由飲食和飲水，定期滅菌消毒飼養籠。實驗過程中，保持環境溫度，室內光照/黑暗每12 h循環，飼養溫度21～25 ℃，相對濕度40%～70%。整個實驗過程中，相關手術操作均嚴格遵守動物倫理學原則。

1.2 儀器與設備

BIOTECH-7BG發酵系統：上海保興生物設備工程有限公司；Concept400M厭氧培養箱：英國Ruskinn公司；AllegraTM 25R低溫高速離心機：美國BECKMAN公司；E100光學顯微鏡：日本Nikon公司；DYY-8C電泳儀：北京市六一儀器廠；SPX-150B-Z生化培養箱：上海博訊實業有限公司；CA-500血液自動分析儀：山東蘭橋醫學科技有限公司；T100梯度聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：伯樂生命醫學產品有限公司；Nano Drop紫外分光光度計：美國Thermo scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離和純化

稱取糞便4.0 g于20 mL無菌生理鹽水中，使用渦旋混合器充分均化，2 000 r/min下離心10 min并懸浮用作人腸道細菌混合物。將細菌混合物用無菌水進行梯度稀釋（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），將稀釋液涂布于MRS固體培養基，37 ℃厭氧培養48～72 h。

挑選大量光滑、邊緣水潤、白色或乳白色的疑似菌落鏡檢，將出現明顯分叉的菌落在GAM固體培養基進行劃線，37 ℃厭氧培養24 h，挑選出嚴格厭氧條件下生長的菌落，進行革蘭氏染色觀察，選取革蘭氏陽性菌落，進一步分離、純化，直至鏡檢顯示為純菌。

1.3.2 菌株的分子生物學鑒定

提取分離菌株的DNA，以其為模板，采用特異性引物Lm26F/Lm3R對菌株的16S rDNA序列進行PCR擴增[18]，PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海生物工程技術服務有限公司進行序列分析。將測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構建系統發育樹，判定細菌種類，將細菌劃分到屬或種。

1.3.3 發酵乳的制備

取1支工作種子凍存管，取200 μL種子液到新鮮茄子瓶斜面上，涂抹均勻后置于37 ℃厭氧培養箱中培養24 h。用無菌接種鏟將斜面上的全部菌苔刮落到新鮮的300 mL種子液體培養基中，置于37 ℃厭氧培養箱中培養24 h。按5%（V/V）的接種量將種子液接種于發酵培養基中，裝液量6 L/7 L，發酵罐溫度37 ℃，轉速200 r/min，發酵過程pH控制為6.5，當補堿瓶中堿液補完后，再繼續培養至發酵液pH降至5.5時發酵結束，將發酵液灌裝至無菌瓶里保存。

1.3.4 發酵乳的活菌檢測

采用平皿澆筑法[19]檢測發酵乳中的活菌數：選擇合適稀釋度的菌液，分別取1 mL加入無菌平皿里，然后將室溫的BBL培養基倒入培養皿中，立即混勻至平板凝固。每個稀釋度重復3次，37 ℃倒置厭氧培養24 h，待菌落長好后，計數并計算出原菌液的活菌數，計算公式如下：

每毫升原菌液活菌數（CFU/mL）=同一稀釋度3個平皿菌落平均數×稀釋倍數。

1.3.5 優勢菌株DD98的傳代穩定性實驗

將長雙歧桿菌DD98在新鮮斜面上連續傳代5次，將不同傳代次數的菌株分別采用MRS液體培養基進行搖瓶發酵（37 ℃厭氧培養24 h），并對發酵液進行活菌計數，考察菌種的傳代穩定性。

1.3.6 小鼠灌胃方案

90只小鼠隨機分為3組，每組30只，一周適應性飼養后，分別灌胃生理鹽水、發酵培養基和DD98發酵乳，灌胃劑量為0.2 mL/只，每天1次，共給藥20 d。在灌胃第0（未灌胃）、5、10、15和20天以及停止灌胃15 d，即第35天時，每組隨機選取5只小鼠，處死，解剖取臟器、糞便。此外，對第0、10、20和35天小鼠進行眼球取血用于血常規檢測。

1.3.7 熒光定量PCR法檢測腸道菌群

在無菌環境下解剖小鼠，冰上操作收集其腸道內已成型糞便3～4粒或結腸內容物200～250 mg，保存在-80 ℃超低溫冰箱。分別使用糞便基因DNA提取試劑盒、Nano Drop紫外分光光度計對腸道內容物進行提取、純化和濃度測定，并使用無菌水進行稀釋。根據文獻[20-23]方法，設計雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和大腸桿菌（Escherichia coli）的特異性引物（見表1），使用熒光定量PCR測定各腸道微生物菌群信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA），熒光定量RCR反應體系（10 μL）：SYBR Green Mixture 5 μL，DNA模板1.0 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference Dye 0.2 μL，雙蒸水（ddH2O）3.0 μL。熒光定量RCR反應條件：95 ℃，30 s，循環1次；95 ℃，5 s，循環40次；65 ℃，5 s，循環40次。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the study

1.3.8 臟器指數的測定[24-26]

各組小鼠解剖腹部后，摘取其臟器（心、肝、脾、肺、腎），用濾紙吸殘血，稱質量，計算臟器指數，計算公式如下：

臟器指數=各臟器質量/小鼠體質量

1.3.9 血常規檢測[27-28]

采用阻抗法，在CA-500血液自動分析儀上進行血常規檢測。共檢測8種血常規指標，包括白細胞計數（white blood cell count，WBC）、紅細胞計數（white blood cell count，RBC）、血紅蛋白（hemoglobin，HGB）、血細胞比容（haematocrit，HCT）、紅細胞平均體積（meancorpuscularvolume，MCV）、紅細胞平均血紅蛋白含量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）、紅細胞平均血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）、血小板（platelet，PLT）。

1.3.10 數據分析

實驗數據表示為“平均值±標準偏差”，使用SPSS 21.0軟件統計分析實驗數據，并進行相應顯著差異分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離及形態觀察

經嚴格厭氧環境培養，成功分離到3株疑似雙歧桿菌菌株，編號分別為P-1、P-2和P-3，3株分離菌株的菌落形態及細胞形態見圖1。由圖1可知，3株菌株的菌落形態無明顯差異，質地柔軟、邊緣整齊、表面光滑、有白色或乳白色的凸起。3株菌革蘭氏染色的結果均為藍紫色，說明均為革蘭氏陽性菌，與雙歧桿菌染色結果一致，顯微鏡下觀察到明顯的“V/Y”分支。

圖1 菌株P-1、P-2和P-3的菌落（a）及細胞（b）形態Fig.1 Colonial (a) and cell (b) morphology of strains P-1,P-2 and P-3

2.2 分離菌株的分子生物學鑒定

3株分離菌株的系統發育樹見圖2。

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株P-1、P-2和P-3的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strains P-1,P-2 and P-3 based on 16S rDNA gene sequences

由圖2可知，菌株P-1、P-2和P-3均與長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）NWAFU002聚于一支，親緣關系最接近，由此可初步確定這3株菌株均為長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）。

2.3 分離菌株發酵能力比較

菌株P-1、P-2和P-3在發酵培養基中發酵后，測定發酵乳中的活菌數，結果見圖3。由圖3可知，菌株P-2制備的發酵乳中長雙歧桿菌活菌數最高，可達2.08×109CFU/mL，而且其發酵乳活菌數在消亡期的下降速度較慢。因此，選擇菌株P-2為優勢菌株，命名為DD98，保藏于實驗室，用于后續實驗。

圖3 菌株P-1、P-2和P-3制備的發酵乳中活菌數檢測結果Fig.3 Detection results of viable counts in fermented milk prepared by strains P-1,P-2 and P-3

2.4 菌株DD98遺傳穩定性研究

將長雙歧桿菌DD98接種于新鮮斜面上連續傳代5次，分別進行搖瓶發酵驗證，活菌計數分別為2.17×109CFU/mL、2.06×109CFU/mL、2.12×109CFU/mL、2.23×109CFU/mL、2.11×109CFU/mL，結果表明，菌株DD98具有較好的遺傳穩定性。

2.5 菌株DD98發酵乳體內特性研究

2.5.1 熒光定量PCR法分析小鼠腸道菌群

各組小鼠雙歧桿菌、乳桿菌、腸球菌、大腸桿菌mRNA表達量見圖4。由圖4A和4B可知，正常小鼠每日連續灌胃DD98發酵乳，在第5、10、15、20天測得的雙歧桿菌、乳桿菌mRNA表達量均顯著高于灌胃生理鹽水或發酵培養基組（P＜0.05），說明菌株DD98發酵乳可以增加正常小鼠胃腸道內有益菌的表達。另外，當小鼠停止灌胃15 d后，灌胃菌株DD98發酵乳的正常小鼠在第35天測得的雙歧桿菌的表達量仍顯著高于灌胃生理鹽水或培養基組（P＜0.05），說明長期飲用菌株DD98發酵乳有利于胃腸道內雙歧桿菌數目的維持；當小鼠停止灌胃15 d后，灌胃菌株DD98發酵乳的正常小鼠在第35天測得的乳桿菌mRNA表達量與灌胃生理鹽水或培養基的組無顯著性差異（P＞0.05），說明暫停使用DD98發酵乳后，乳桿菌的表達恢復到了原先的水平。由圖4C和4D可知，正常小鼠每日連續灌胃菌株DD98發酵乳，在第5、10、15、20天測得的腸球菌、大腸桿菌mRNA表達量均顯著低于灌胃生理鹽水或培養基組（P＜0.05），說明菌株DD98發酵乳可以減少正常小鼠胃腸道內有害菌的表達。另外，當小鼠停止灌胃15 d后，灌胃菌株DD98發酵乳的正常小鼠在第35天測得的腸球菌、大腸桿菌mRNA表達量與灌胃生理鹽水或發酵培養基組無顯著性差異（P＞0.05），說明暫停使用菌株DD98發酵乳后，腸球菌、大腸桿菌的表達恢復到了原先的水平。

圖4 各組小鼠雙歧桿菌（A）、乳桿菌（B）、小鼠腸球菌（C）、大腸桿菌（D）mRNA表達量Fig.4 Expression quantity of mRNA of Bifidobacterium (A), Lactobacillus(B),Enterococcus(C)and Enterobacter(D)of mice in each group

2.5.2 體質量及臟器指數分析

圖5 各組小鼠體質量變化Fig.5 Changes of body mass of mice in each group

各組小鼠體質量變化見圖5。由圖5可知，隨著時間的推移，灌胃生理鹽水或發酵培養基或菌株DD98發酵乳的小鼠體質量均呈上升趨勢且三組小鼠的體質量無顯著性差異（P＞0.05），說明灌胃菌株DD98發酵乳不會影響小鼠生長。

各組小鼠臟器指數見表2。由表2可知，連續灌胃菌株DD98發酵乳0、5、10 d后，正常小鼠臟器指數與連續灌胃20 d的生理鹽水或發酵培養基的正常小鼠的臟器指數無顯著性差異（P＞0.05）；而在第15天和第20天，與灌胃生理鹽水或發酵培養基的小鼠相比有顯著性差異（P＜0.05）。停止灌胃15 d，即第35天，灌胃菌株DD98發酵乳的小鼠也與灌胃生理鹽水或發酵培養基的小鼠的臟器指數無顯著性差異（P＞0.05），說明長期灌胃菌株DD98發酵乳有利于小鼠臟器的生長，對小鼠生長是有益的。

表2 各組小鼠臟器指數測定結果Table 2 Determination results of visceral coefficients in different groups of mice

2.5.3 血常規分析

各組小鼠血常規值見表3。由表3可知，連續灌胃20 d，灌胃菌株DD98發酵乳組正常小鼠血常規各項指標值與連續灌胃20 d的生理鹽水或發酵培養基的正常小鼠無顯著性差異（P＞0.05）。停止灌胃15 d，即第35天，灌胃菌株DD98發酵乳組小鼠也與灌胃生理鹽水或發酵培養基的小鼠的血常規的各項指標無顯著性差異（P＞0.05），說明服用菌株DD98發酵乳不會對正常小鼠產生不良反應。

表3 各組小鼠血常規值測定結果Table 3 Determination results of blood routine index of mice in different groups of mice

續表

3 結論

本研究采用MRS培養基，結合菌落形態觀察和16SrDNA基因序列同源性分析，從健康的成人糞便中分離到3株長雙歧桿菌（P-1、P-2、P-3）并鑒定，其中，菌株P-2發酵能力較強，活菌數最高，遺傳穩定較好，被命名為DD98。將菌株DD98作為長雙歧桿菌產品開發的優勢菌株，用于菌株DD98發酵乳研究。通過正常小鼠體內特性研究發現，服用菌株DD98發酵乳能顯著增加小鼠胃腸道內有益菌、減少有害菌的表達（P＜0.05），具有調節腸道菌群的作用。此外，能維持小鼠正常的體質量、血常規指數，有利于小鼠臟器的生長，這對菌株DD98產品的開發奠定了基礎。