清香型白酒酒醅發(fā)酵菌株分離鑒定及細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

劉雪婷，王子媛，劉繼明，劉忠軍，郭 壯，侯強(qiáng)川*

（1.湖北文理學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院 鄂西北傳統(tǒng)發(fā)酵食品研究所，湖北 襄陽 441053；2.湖北省石花釀酒股份有限公司，湖北 襄陽 441705）

中國(guó)白酒歷史悠久，根據(jù)香型的不同可以分為濃香型白酒、清香型白酒、醬香型白酒等[1]，由于釀造工藝不同，不同香型白酒的口感和風(fēng)味也存在較大差異[2]。長(zhǎng)期以來，清香型白酒因其具有的獨(dú)特果香和花香風(fēng)味而受到消費(fèi)者喜愛。清香型白酒以高粱等谷物為主要原料，以大曲為糖化發(fā)酵劑，采用清蒸清糟釀造工藝、固態(tài)地缸發(fā)酵、蒸餾、二渣發(fā)酵和勾兌而成。清香型白酒大曲微生物組成十分復(fù)雜，除含有產(chǎn)淀粉酶的霉菌、合成酒精的酵母菌外，還含有豐富的細(xì)菌，如芽孢桿菌和乳酸菌等，這些微生物對(duì)于產(chǎn)品最終的品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。目前，國(guó)內(nèi)的學(xué)者以酒醅為研究對(duì)象，對(duì)其中的微生物群系開展了一些研究，如李欣等[3]通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)醬香型白酒酒醅進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，酒醅中的優(yōu)勢(shì)微生物是乳桿菌屬、醋酸桿菌屬、青霉菌屬等。楊磊等[4]通過對(duì)沉香型白酒的上下層酒醅進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)上層酒醅中細(xì)菌的多樣性較下層酒醅更為豐富，而乳酸桿菌屬是上下層酒醅的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，然而目前針對(duì)清香型白酒酒醅中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究尚少。

目前，研究者對(duì)環(huán)境中微生物菌株的分離主要基于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，而對(duì)于樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)的解析則多采用基于測(cè)序技術(shù)的非培養(yǎng)方法[5]。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)對(duì)于獲取樣本中的細(xì)菌菌株必不可少，這是后續(xù)進(jìn)一步篩選優(yōu)良發(fā)酵菌株的基礎(chǔ)。以測(cè)序技術(shù)為代表的非培養(yǎng)方法可以解析更多不可培養(yǎng)微生物，極大的提高了人們對(duì)樣本中微生物群落結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)。在眾多測(cè)序技術(shù)中，Illumina MiSeq高通量測(cè)序具有通量大、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)[6]，是目前使用最為廣泛的測(cè)序技術(shù)之一，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛的運(yùn)用于白酒[7]和腐乳[8]等發(fā)酵食品領(lǐng)域。

本研究從湖北省襄陽市石花酒廠中采集了5份清香型白酒酒醅樣品，采用純培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)酒醅中的乳酸菌和芽孢桿菌進(jìn)行了分離鑒定，同時(shí)通過Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)解析清香型白酒酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，為適用于清香型白酒發(fā)酵的優(yōu)良菌株篩選奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

酒醅：采集自湖北省石花釀酒股份有限公司的5份清香型白酒的酒醅樣品，分別命名為SH1、SH2、SH3、SH4以及SH5；樣品采集后裝入采樣袋并迅速置于含有冰袋的采樣箱，冷鏈運(yùn)送回實(shí)驗(yàn)室于24 h內(nèi)完成所有樣品宏基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取。

1.1.2 試劑

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit DNA基因組提取試劑盒：德國(guó)QIAGEN公司；MRS培養(yǎng)基、R2A瓊脂培養(yǎng)基、石蕊牛乳培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；引物27F/1495R和M13F（-47）/M13R（-48）：武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CT15RE臺(tái)式冷凍離心機(jī)：日本HITACHI公司；Veriti梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)Life公司；ND-2000C微量紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)：美國(guó)Protein Simple公司；Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；R930機(jī)架式服務(wù)器：美國(guó)Dell公司；DG250厭氧工作站：英國(guó)Don Whitley公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌和芽孢桿菌的分離鑒定

取10 g酒醅樣品于90 mL石蕊牛乳培養(yǎng)基中，搖勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，采用倍比稀釋法將富集培養(yǎng)后的酒醅樣品用生理鹽水稀釋至10-3～10-6梯度，其中一份稀釋樣品涂布于含1%碳酸鈣的MRS瓊脂培養(yǎng)基用于乳酸菌的分離。另一份稀釋液在75 ℃條件下水浴15 min，然后涂布于R2A瓊脂培養(yǎng)基中用于芽孢桿菌的分離。將用于乳酸菌分離的固體培養(yǎng)基倒置于37 ℃的厭氧工作站中培養(yǎng)48 h（厭氧條件為85%N2，10%H2以及5%CO2），而將用于芽孢桿菌分離的固體培養(yǎng)基倒置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。隨后將固體培養(yǎng)基中菌落總數(shù)在30～300個(gè)的平板用于菌落挑選，盡量挑選顏色、形態(tài)和大小均不相同的單菌落，同時(shí)乳酸菌菌落需要有溶鈣圈。根據(jù)三區(qū)劃線法將乳酸菌和芽孢桿菌單菌落分別在MRS固體平板和R2A固體平板中連續(xù)劃線3次后，將過氧化氫酶陰性及革蘭氏陽性的疑似乳酸菌菌株和經(jīng)過芽孢染色鏡檢后的疑似芽孢菌株用30%的甘油進(jìn)行保存處理。分別參照李娜等[9-10]的方法，提取疑似乳酸菌和芽孢桿菌菌株DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳合格的PCR樣品進(jìn)行純化后寄往武漢天一輝遠(yuǎn)有限公司進(jìn)行測(cè)序，將返回的測(cè)序序列通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）網(wǎng)站進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic localalignment search tool，BLAST）同源比對(duì)分析，并根據(jù)MEGA7.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，判定目的菌株的系統(tǒng)發(fā)育地位。

1.3.2 宏基因組DNA的提取及Illumina MiSeq測(cè)序

參照沈馨等[11]的方法，采用QIAGEN DNeasy PowerSoil Pro Kit 基因組提取試劑盒對(duì)酒醅樣品進(jìn)行宏基因組DNA的提取，以其為模板，使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)樣品16S rRNA V3-V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，將檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物寄往上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測(cè)序。

1.3.3 序列質(zhì)控和生物信息學(xué)分析

將返回的序列根據(jù)核苷酸標(biāo)簽（barcode）信息分配到各個(gè)樣品中，同時(shí)去除barcode和引物。參照王玉榮等[12]的方法進(jìn)行質(zhì)控，去除嵌合體序列以及堿基錯(cuò)配序列。測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控后，使用QIIME（V1.9.1）平臺(tái)進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析。具體步驟如下：將高質(zhì)量的序列進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)和對(duì)齊[13]，根據(jù)97%的相似度進(jìn)行操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT）聚類，去除屬于嵌合體的OTU序列。使用核糖體數(shù)據(jù)庫項(xiàng)目（ribosomal database project，RDP）classifier結(jié)合目前最常用的RDP Release 11.5[14]、Greengene（Version 13.8）[15]和Sliva（Version 132）[16]數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對(duì)確定各OTU的分類學(xué)地位，使用內(nèi)部腳本整合三個(gè)數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果，確定各OTU的最終分類學(xué)地位。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用R繪制Upset圖和瀑布圖，使用BioEdit和MEGA7.0（http：//www.megasoftware.net/）軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，使用Origin（V8.6）軟件完成柱形圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離與鑒定

本研究共從5份酒醅樣品中分離得到13株疑似乳酸菌菌株。所有菌株均可形成溶鈣圈，經(jīng)革蘭氏染色呈陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)為陰性。在提取菌株DNA的基礎(chǔ)上，利用16S rRNA序列分析方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，分離株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示。

圖1 基于16S rRNA基因序列13株乳酸菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 13 strains of lactic acid bacteria and standard strains based on 16S rRNA gene sequences

由圖1可知，13株乳酸菌分離株分別鑒定為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）4 株、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）3 株、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）3 株、糞腸球菌（Enterococcus faecium）2 株、希爾氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）1 株，所有菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性均在99%以上。

2.2 芽孢桿菌的分離與鑒定

本研究共分離得到17株疑似芽孢桿菌（Bacillus）菌株，將各菌株提取DNA后，利用16S rRNA序列分析方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，分離菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

圖2 基于16S rRNA基因序列17株芽孢桿菌與標(biāo)準(zhǔn)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of 17 strains of Bacillus and standard strains based on 16S rRNA gene sequences

由圖2可知，分離得到的17株菌株分別鑒定為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）9 株、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）2 株、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）2 株、澳洲芽孢桿菌（Bacillus australimaris）2 株、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）1株以及蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）1株，其同源性均達(dá)到99%以上。

2.3 基于門和屬水平的清香型白酒酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)酒醅樣品進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)評(píng)價(jià)，共產(chǎn)生180 749條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)酒醅樣品產(chǎn)生36 150條序列。在細(xì)菌門水平，平均相對(duì)含量大于0.5%的細(xì)菌門在各樣品中的分布如圖3所示。

圖3 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門相對(duì)含量分析Fig.3 Analysis of relative abundance of dominant bacteria phylum

由圖3可知，酒醅樣品中最為豐富的細(xì)菌門是厚壁菌門（Firmicutes），其相對(duì)含量為97.96%，其次分別為放線菌門（Actinobacteria）（1.24%）和變形菌門（Proteobacteria）（0.76%）。由此可見，酒醅中的厚壁菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位。進(jìn)一步對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬的分布進(jìn)行分析，各優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)含量的柱形圖如圖4所示。

圖4 優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬相對(duì)含量分析Fig.4 Analysis of relative abundance of dominant bacteria genus

由圖4可知，酒醅樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、嗜熱菌屬（Thermoleophilum）和假單胞菌屬（Pseudomonas），上述菌屬的平均相對(duì)含量分別為97.42%、1.22%和0.72%。

2.4 酒醅中細(xì)菌在OTU水平的特征

在97%的條件下劃分OTU并去除嵌合體后，共得到3 761個(gè)OTU。本研究將僅在某一樣品中出現(xiàn)的OTU定義為該樣品的特有OTU，將在所有樣品中均出現(xiàn)的OTU定義為酒醅的核心OTU。OTU水平的UpSet分析如圖5所示。

圖5 基于OTU的UpSet分析Fig.5 UpSet analysis based on OTU

由圖5可知，SH3中總的OTU數(shù)量和特有OTU數(shù)量最為豐富，其特有OTU數(shù)量為798個(gè)，其次為SH5、SH4、SH1和SH2，其數(shù)量分別為588個(gè)、557個(gè)、505個(gè)和418個(gè)。值得注意的是，酒醅中的核心OTU有280個(gè)，其中的257個(gè)核心OTU主要注釋結(jié)果為乳桿菌屬（Lactobacillus），另有少數(shù)OTU注釋為假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和嗜熱菌屬（Thermoleophilum），核心OTU中包含的序列占總測(cè)序序列數(shù)的96.60%。由此可見，雖然不同酒醅樣品中微生物的豐度存在一定的差異，但是核心OTU組成相似，且在樣品中占有較高的比例。本研究將平均相對(duì)含量大于0.5%的核心OTU定義為核心優(yōu)勢(shì)OTU，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有8個(gè)OTU滿足該閾值條件，這些OTU在樣品中的平均相對(duì)含量分析如圖6所示。

圖6 基于核心優(yōu)勢(shì)OTU的瀑布圖Fig.6 Waterfall chart based on core advantage OTU

由圖6可知，酒醅樣品中的核心優(yōu)勢(shì)OTU中的6個(gè)可以注釋為乳桿菌屬（Lactobacillus），另有兩個(gè)OTU分別注釋為嗜熱菌屬（Thermoleophilum）和假單胞菌屬（Pseudomonas），該結(jié)果表明乳酸桿菌在清香型白酒酒醅中占據(jù)核心地位，預(yù)示著其在酒醅的發(fā)酵過程中可能起著非常重要的作用。

3 討論

酒醅是正在發(fā)酵或已發(fā)酵好的固體物料，酒醅的質(zhì)量直接決定了清香型白酒的質(zhì)量。酒醅在堆積的過程中，除了利用大曲中的微生物外，還能夠吸附空氣以及生產(chǎn)環(huán)境中的微生物，這些微生物共同決定了成品酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)。因此，全面解析清香型白酒酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)于后期改善清香型白酒風(fēng)味和品質(zhì)有重要作用。

本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)清香型白酒酒醅中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析發(fā)現(xiàn)，酒醅樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、嗜熱菌屬（Thermoleophilum）和假單胞菌屬（Pseudomonas），上述菌屬累計(jì)相對(duì)含量占細(xì)菌總數(shù)99%以上，表明乳酸菌是清香型白酒的發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌。王雪山等[17]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、Kroppenstedtia和單胞菌屬（Pseudomonas）是清香型白酒酒醅中的優(yōu)勢(shì)菌屬，其中乳桿菌屬（Lactobacillus）是發(fā)酵后期酒醅中的主要菌屬；賈麗艷等[18]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌屬（Lactobacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）在山西省杏花村某酒企清香型白酒酒醅中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，上述研究結(jié)果與本研究接近。乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的細(xì)菌的統(tǒng)稱[19]，不僅在人體中發(fā)揮著重要的生理功能，在白酒的發(fā)酵過程中也是不可缺少的。乳酸菌在白酒發(fā)酵過程中對(duì)雜菌生長(zhǎng)有一定的抑制作用，此外乳酸能夠和乙醇生成乳酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)，這是清香型白酒的主體風(fēng)味之一[20]。酒醅中含有豐富的嗜熱菌，這可能與釀酒發(fā)酵過程產(chǎn)生的高溫環(huán)境有關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白水解酶，為美拉德反應(yīng)提供所需的氨基酸，生成香味以及香味的前體物質(zhì)[21]，從而在一定程度上影響發(fā)酵白酒的風(fēng)味。值得注意的是，假單胞菌屬（Pseudomonas）是很多清香型白酒酒醅樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬，該菌屬多數(shù)情況是條件致病菌，但其在清香型白酒釀造中的作用尚不清楚。

本研究通過傳統(tǒng)的分離技術(shù)從清香型酒醅樣品中分離鑒定出17株芽孢桿菌。然而Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)的結(jié)果顯示，芽孢桿菌在酒醅樣品中的相對(duì)含量較低，這與王雪山等[17-18]的研究結(jié)果一致。這種情況的出現(xiàn)可能與本研究芽孢桿菌分離過程中的水浴處理有很大關(guān)系，由于芽孢桿菌較為耐熱，水浴處理后大部分芽孢桿菌可以存活，而其他細(xì)菌被殺滅，提高了芽孢桿菌分離效率。芽孢桿菌是一類廣泛存在于環(huán)境中的微生物，由于其所具有的各種生理功能，已經(jīng)廣泛的運(yùn)用于食品加工[22]和農(nóng)藥降解[23]等領(lǐng)域?，F(xiàn)在，越來越多的研究顯示，芽孢桿菌在白酒的釀造過程中占有重要的作用。芽孢桿菌的代謝產(chǎn)物中含有十幾種風(fēng)味物質(zhì)以及許多重要的酯類物質(zhì)[24]，楊帆等[25]通過對(duì)茅臺(tái)大曲中的3種芽孢桿菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌發(fā)酵后生成了乙偶姻、三甲基吡嗪等風(fēng)味成分，具有促進(jìn)大曲風(fēng)味物質(zhì)形成的作用。此外，芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶和淀粉酶，在固態(tài)白酒的發(fā)酵過程中，能夠有效的降解蛋白和纖維等物質(zhì)，從而提高原料的利用率[26]。

4 結(jié)論

本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)以及傳統(tǒng)純培養(yǎng)的方法對(duì)清香型白酒酒醅的細(xì)菌群落進(jìn)行全面解析，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為乳桿菌屬（Lactobacillus）、嗜熱菌屬（Thermoleophilum）和單胞菌屬（Pseudomonas），豐富了人們對(duì)清香型白酒酒醅細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)。所有酒醅樣品共分離得到13株乳酸菌以及17株芽孢桿菌，這為后續(xù)篩選適用于清香型白酒發(fā)酵的優(yōu)良菌株奠定了一定基礎(chǔ)。