高濃麥汁中添加紅棗汁對酵母發(fā)酵性能及啤酒風(fēng)味的影響

張曉榮，廖劍橋，雷宏杰*

（西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

在我國，啤酒行業(yè)存在生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品種類單一、缺乏特色與創(chuàng)新等問題[1]，在保證產(chǎn)品質(zhì)量的情況下降低生產(chǎn)成本以保證效益，同時推出更多風(fēng)格的產(chǎn)品，加大市場競爭力，是啤酒企業(yè)亟需解決的問題。啤酒高濃釀造技術(shù)（指用15°P以上的麥汁釀造啤酒的工藝）具有諸多優(yōu)點(diǎn)，它可減少生產(chǎn)成本、降低能源消耗、縮短生產(chǎn)周期[2-4]。同時，高濃釀造技術(shù)還有助于提高啤酒的非生物穩(wěn)定性，促使冷渾濁蛋白的沉淀，對啤酒風(fēng)味具有改善作用，發(fā)酵后的高酒精度有利于抑制雜菌生長，提高單位浸出物的酒精產(chǎn)率等[5]。此外，由于其獨(dú)特的釀造工藝，已被廣泛應(yīng)用于淡爽型啤酒的釀造[6-7]。

然而，啤酒高濃釀造技術(shù)存在一些弊端[8]：延長了啤酒發(fā)酵時間，酵母的活力與存活率下降；啤酒風(fēng)味穩(wěn)定性變差，高濃釀造的啤酒與常濃釀造的啤酒風(fēng)味存在差異，采用該技術(shù)常導(dǎo)致啤酒醇酯不協(xié)調(diào)；啤酒泡沫穩(wěn)定性變差，啤酒的泡持性降低；酒花利用率降低。此外，酵母細(xì)胞在高濃釀造過程中往往面臨更嚴(yán)峻的環(huán)境脅迫，主要來自兩方面[9]：一方面，發(fā)酵初期更高的麥汁濃度導(dǎo)致麥汁體系滲透壓更高，不利于酵母的生長；另一方面，發(fā)酵結(jié)束時乙醇濃度更高，導(dǎo)致細(xì)胞面臨更強(qiáng)的毒性，致使酵母存活率下降，活細(xì)胞數(shù)減少，不利于酵母的重復(fù)使用。酵母可調(diào)控自身代謝以適應(yīng)環(huán)境變化，但當(dāng)環(huán)境過于苛刻，或超出酵母適應(yīng)范圍，會對酵母的發(fā)酵性能以及生理特性等造成不利的影響[10]。

高濃麥汁中補(bǔ)充營養(yǎng)物質(zhì)是一種行之有效的方法。在高濃麥汁中添加氮源、麥角固醇以及油酸時，可促進(jìn)酵母生長、提高乙醇產(chǎn)量，發(fā)酵結(jié)束時活細(xì)胞率仍保持在較高水平[11]。添加S-腺苷甲硫氨酸可提高巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）在高濃釀造過程中的發(fā)酵速率[1]。在麥汁中直接添加氨基酸、肽、蛋白水解物或蛋白酶，也可提高酵母在高濃釀造過程中的發(fā)酵性能：乙醇對細(xì)胞的生長具有抑制作用，但添加精氨酸可以大大減輕乙醇損傷，相反，當(dāng)胞內(nèi)精氨酸含量減少時，酵母細(xì)胞對乙醇濃度更敏感[12]。

紅棗（Ziziphus jujubaMill）是鼠李科屬植物棗樹的成熟果實(shí)，營養(yǎng)豐富，藥用價值高，富含蛋白質(zhì)、脂肪、多糖、胡蘿卜素、B族維生素、維生素C、維生素P以及鈣、磷、鐵等成分，其中維生素C的含量在果品中名列前茅，有“天然維生素丸”之美稱。我國是世界上最大的紅棗生產(chǎn)國，同時也是最大的紅棗及其加工品出口國，全球90%以上的紅棗都由我國供應(yīng)，市場占有率高。2018年全國紅棗年產(chǎn)量高達(dá)883多萬噸，占世界總產(chǎn)量的1/3。在人們生活水平不斷提高的當(dāng)今社會，隨著保健食品行業(yè)的快速興起，紅棗以其豐富的營養(yǎng)價值及多種保健功能成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[13]。

本研究以紅棗作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑，通過制備紅棗汁，將紅棗汁添加到高濃麥汁中進(jìn)行啤酒發(fā)酵，分析其對高濃釀造過程中酵母發(fā)酵性能及啤酒風(fēng)味的影響。研究結(jié)果對啤酒高濃釀造工業(yè)生產(chǎn)中通過營養(yǎng)物調(diào)控酵母發(fā)酵性能的實(shí)踐研究具有一定的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

巴氏酵母（Saccharomyces pastorianus）BF16：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 原料與試劑

陜北木棗：采于榆林市清澗縣；青島純生啤酒：市售；大麥芽：廈門市老啤匠貿(mào)易有限公司；酒花顆粒：西安雪花啤酒有限公司；麥芽糖漿：湖北千鳳香食品有限公司；2-辛醇（色譜純）：范德（北京）生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步琦有限公司；WGL-230B烘箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；CM-5色差計(jì)：科電貿(mào)易（上海）有限公司；LRH-250CL低溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PAL-1數(shù)字手持折射儀：日本ATAGO（愛宕）公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GL-10MD高速冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DMA 35安東帕便攜式密度計(jì)：奧地利安東帕有限公司；GCMSQP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 高濃麥汁的制備

稱取一定量的大麥芽，粉碎并過篩，以料液比1∶4（g∶mL）加入45 ℃蒸餾水，攪拌并開始糖化，糖化程序如下：在45 ℃下保溫30 min；升溫至63 ℃并保溫60 min；再升溫至72 ℃并保溫10 min；最后將溫度升至78 ℃，保溫10 min。均以1 ℃/min的速率升溫。

糖化結(jié)束后，將麥汁迅速冷卻至45 ℃后過濾，將濾液再次加溫至沸騰，保持沸騰狀態(tài)90 min。在麥汁沸騰后，分3次添加酒花顆粒[14]，添加量為麥芽質(zhì)量的0.2%。

煮沸完成后，將麥汁再次過濾，使用蒸餾水調(diào)整麥汁濃度至常濃（12°P）。向常濃麥汁中加入麥芽糖漿，調(diào)整濃度至24°P，并分裝至2 L的錐形瓶中。將所得高濃麥汁進(jìn)行高壓滅菌（121 ℃，15 min）。

1.3.2 紅棗汁制備

稱取一定量的紅棗，洗凈后加入一定量溫水浸泡10min，破碎后于45 ℃下浸提4 h，料液比為1∶4（g∶mL）。浸提完成后，將棗汁進(jìn)行過濾。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將所得棗汁進(jìn)行濃縮，調(diào)整紅棗汁糖度與高濃麥汁一致，將棗汁進(jìn)行巴氏殺菌（80 ℃，10 min），備用，高濃麥汁和高濃紅棗汁的氨基酸組成見表1。

表1 高濃麥汁和高濃紅棗汁的氨基酸組成Table 1 Composition of amino acids in high gravity wort and jujube juice

1.3.3 接種酵母及啤酒發(fā)酵

分別添加10%、15%、20%、25%、30%、35%的紅棗汁于高濃麥汁中。對麥汁進(jìn)行高溫滅菌（121 ℃，15 min）。以2 g/L的接種量接種酵母。無菌條件下，先以少量麥汁將活性干酵母活化（37 ℃，30 min），之后將酵母轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，開始發(fā)酵。接種酵母后，將錐形瓶轉(zhuǎn)移至低溫培養(yǎng)箱中，于12 ℃下進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵期間，每日搖瓶稱質(zhì)量。當(dāng)發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液離心（6 000 r/min、4 ℃、10 min），離心所得酵母泥用于酵母計(jì)數(shù)及測定活細(xì)胞率，上清液保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.4 分析檢測

（1）發(fā)酵度測定

使用附溫比重瓶對發(fā)酵后的麥汁濃度進(jìn)行測定：將比重瓶洗凈烘干至恒質(zhì)量，將蒸餾水或離心所得上清液緩慢倒入比重瓶中，避免產(chǎn)生氣泡。使之升溫至20 ℃并準(zhǔn)確稱量其在該溫度下的質(zhì)量，計(jì)算得到麥汁與蒸餾水的質(zhì)量比。根據(jù)比重與浸出物質(zhì)量百分含量對照表查得20 ℃下麥汁中浸出物含量，并以°P表示。發(fā)酵度計(jì)算公式如下：

（2）酒精度測定

使用密度計(jì)直接對酒精度進(jìn)行測定：取離心后上清液與蒸餾水各50 mL，加入蒸餾燒瓶中進(jìn)行蒸餾，準(zhǔn)確收集餾出液50 mL，用儀器直接吸取餾出液并讀數(shù)，酒精度單位以體積分?jǐn)?shù)%vol表示。

（3）風(fēng)味物質(zhì)測定

采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，與常婷婷等[15]相同的條件進(jìn)行分析：在20 mL頂空瓶中加入6 mL樣品、1.5 g NaCl以及20 mg/mL的2-辛醇標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，此時樣品中2-辛醇實(shí)際質(zhì)量濃度為66.7 μg/mL，加蓋密封后進(jìn)行測定分析。未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索同時與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）和Wileylibrary數(shù)據(jù)庫相匹配，保留指數(shù)＞85的結(jié)果，所得風(fēng)味物質(zhì)為相對于內(nèi)標(biāo)的含量。

色譜條件：色譜柱為DB-1 ms毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；起始柱溫40 ℃；進(jìn)樣口溫度230 ℃；程序升溫：40℃保持3min，然后以4℃/min速度升至120 ℃，再以6 ℃/min升至240℃，保持9min；載氣為高純氦氣（He），流速1.0mL/min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃，電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70eV，質(zhì)量掃描范圍35～400amu。

（4）色值測定

使用色差儀對啤酒的色值進(jìn)行測定。以商品啤酒青島純生作為對照，根據(jù)發(fā)酵得到啤酒的酒精度，按不同比例將之稀釋至與青島純生相同的酒精度（3.3%vol）。使用蒸餾水對色差儀進(jìn)行調(diào)零，測定所有樣品與青島純生的L*值、a*值、b*值，計(jì)算總色差，其計(jì)算公式如下：

式中：ΔE為總色差；ΔL*為明度差；Δa*為紅綠色差；Δb*為黃藍(lán)色差。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

各數(shù)據(jù)均為3次測定的平均值，采用Minitab 18（Minitab Inc.）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Fisher最小顯著差數(shù)（least significant difference，LSD）法進(jìn)行顯著性分析。其中，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。使用Excel 2019作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加紅棗汁對高濃釀造過程中CO2質(zhì)量損失的影響

添加不同比例紅棗汁進(jìn)行啤酒發(fā)酵的過程中，CO2質(zhì)量損失情況見圖1。由圖1可知，接種酵母后的第1天，各組CO2質(zhì)量損失均較少。從第2天開始CO2質(zhì)量損失迅速增加，單日質(zhì)量損失量達(dá)到峰值。其中添加15%紅棗汁組最高單日CO2質(zhì)量損失達(dá)9.8 g/L。隨后增速減緩，曲線趨于平穩(wěn)。發(fā)酵結(jié)束時，對照組總CO2質(zhì)量損失為92.6 g/L，添加15%紅棗汁組總CO2質(zhì)量損失為95.2 g/L，添加25%紅棗汁組最低為92.6 g/L。

圖1 發(fā)酵期間各組CO2質(zhì)量損失Fig.1 CO2 mass loss of each group during the fermentation

在發(fā)酵前期（發(fā)酵開始至第5天），添加不同比例紅棗汁的樣品組總CO2質(zhì)量損失均高于對照組；發(fā)酵中期（6～12 d），對照組總CO2質(zhì)量損失反超各紅棗汁添加組；發(fā)酵臨近結(jié)束時（13～14 d），所有添加紅棗汁的樣品組總CO2質(zhì)量損失再次超過對照組。這可能是由于發(fā)酵前期麥汁體系的滲透壓較高，添加紅棗汁提高了酵母細(xì)胞對高滲透壓的耐受性，因此在發(fā)酵前期酵母的活性更強(qiáng)，表現(xiàn)出更高的發(fā)酵能力，酵母細(xì)胞可以快速消耗利用各種營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖與發(fā)酵，產(chǎn)生大量的代謝物，如乙醇等[16-17]。與麥汁相比，紅棗汁富含脯氨酸（表1），已有研究表明，脯氨酸可參與酵母提高自身耐受性的分子機(jī)制，保持胞內(nèi)蛋白和質(zhì)膜的穩(wěn)定性、降低脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的熔解溫度（Tm）值、清除活性氧自由基等[18]。

2.2 添加紅棗汁對麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量的影響

發(fā)酵度反映了酵母對糖的消耗利用程度，各組發(fā)酵度結(jié)果見圖2。由圖2可知，添加不同比例的紅棗汁均能顯著提高發(fā)酵度（P＜0.01），其中對照組發(fā)酵度最低，為84.66%；30%紅棗汁組發(fā)酵度最高，為88.18%，其次是35%紅棗汁組，發(fā)酵度達(dá)87.90%。在本試驗(yàn)紅棗汁添加范圍內(nèi)（10%～35%），發(fā)酵度由高到低可分為四組：30%、35%＞20%、25%、15%＞10%＞對照（組內(nèi)不存在顯著差異）。結(jié)果表明，紅棗汁添加量越高，最終的發(fā)酵度也越高。

各組乙醇產(chǎn)量結(jié)果見圖3。由圖3可知，添加不同比例的紅棗汁均能一定程度提高乙醇產(chǎn)量，其中，對照組酒精度為10.80%vol。15%、35%紅棗汁組顯著高于對照組（P＜0.05），30%紅棗汁組酒精度達(dá)11.30%vol，極顯著高于對照組（P＜0.01）。

圖2 添加紅棗汁對麥汁發(fā)酵度的影響Fig.2 Effect of jujube juice supplementation on wort fermentation degree

圖3 添加紅棗汁對乙醇產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of jujube juice supplementation on ethanol production

本研究結(jié)果與文獻(xiàn)[19]報道結(jié)果類似，可能是由于相較于麥汁中較為單一的營養(yǎng)組成，紅棗汁的成分更為復(fù)雜多樣，其中的高含量脯氨酸有助于提高酵母細(xì)胞在高濃環(huán)境下的活力，促進(jìn)細(xì)胞對糖的利用與轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞能夠在更高的乙醇濃度下依然保持提高乙醇產(chǎn)量，并且對高乙醇濃度具有更高的耐受性。

2.3 添加紅棗汁對啤酒色值的影響

顏色是啤酒重要的感官指標(biāo)之一，啤酒的顏色給消費(fèi)者的第一印象是消費(fèi)者選擇啤酒時的重要依據(jù)。通常用EBC值來反映啤酒的色度，國標(biāo)GB 4927—2008《啤酒》中規(guī)定，色度2～14 EBC的為淡色啤酒，15～40 EBC為濃色啤酒，41 EBC以上為黑色啤酒。但是EBC比色法需要實(shí)驗(yàn)人員肉眼觀察，人為因素導(dǎo)致的誤差更大。采用國際照明委員會（commission internationale de l'Eclairage，CIE）的Lab顏色體系，對啤酒的色值進(jìn)行表示與分析。不同紅棗汁添加量對啤酒色值的影響見表2。

對照組及各樣品組均與青島純生進(jìn)行比較。由表1可知，各組在L*值、a*值、b*值上均與青島純生啤酒存在顯著差異（P＜0.05），其中對照組與青島純生之間的差異最小。隨著紅棗汁添加比例越高，啤酒的L*值降低，a*值升高，b*值升高，總色差（ΔE）值越大。35%紅棗汁組亮度最低，a*值與b*值最高，與青島純生及對照組的差異最大。

表2 紅棗汁添加量對啤酒色值的影響Table 2 Effect of jujube juice supplementation on beer color value

在Lab顏色體系中，L*值表示亮度，a*值由負(fù)到正表示由綠到紅，b*值由負(fù)到正表示由藍(lán)到黃，即紅棗汁的添加導(dǎo)致啤酒的亮度下降，并呈現(xiàn)出更多的紅色與黃色。這是由于紅棗汁中含有豐富的色素，當(dāng)紅棗汁的添加比例增加時，溶解到啤酒中的色素也越多，因此啤酒的色值與紅棗汁的添加量同步變化。

2.4 添加紅棗汁對啤酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

添加不同比例的紅棗汁對啤酒風(fēng)味的影響見表3。由表3可知，在7個組中一共檢測到50種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括10種醇類物質(zhì)、33種酯類物質(zhì)和7種酸類物質(zhì)，其中以醇類、酯類物質(zhì)含量最高。在所有樣品中風(fēng)味物質(zhì)含量較高的有：異戊醇、活性戊醇、苯乙醇三種醇類物質(zhì)，乙酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、乙基9-癸烯酸酯、癸酸乙酯六種酯類物質(zhì)。在對照組中，醇類及酯類物質(zhì)含量占風(fēng)味物質(zhì)總量的94.1%。添加紅棗汁導(dǎo)致啤酒的醇酯比有所降低，這是由于總醇的含量降幅大于總酯含量降幅，其中主要是異戊醇、活性戊醇等高級醇含量降低。高級醇是大多數(shù)風(fēng)味酯的前體物質(zhì)，并且高級醇的產(chǎn)生與蛋白質(zhì)的合成之間有著密切的聯(lián)系，它是氨基酸分解代謝的副產(chǎn)物。而細(xì)胞對乙酸酯類的合成則主要由醇乙?；D(zhuǎn)移酶催化一分子高級醇（或乙醇）和一分子活化的乙酰輔酶A形成。添加紅棗汁導(dǎo)致啤酒異戊醇含量僅為對照組的69.3%～77.9%，活性戊醇含量為對照組的68.8%～74.8%。對照組表現(xiàn)在最高的醇酯比，為1.01，而添加20%和25%紅棗汁的啤酒表現(xiàn)出了最低的醇酯比，均為0.87。高級醇是導(dǎo)致啤酒“上頭”的主要原因[20]，因此，高級醇含量的降低可以減輕飲用啤酒對身體造成的不適，有益身體健康。結(jié)果表明，添加紅棗汁進(jìn)行發(fā)酵的啤酒表現(xiàn)出較強(qiáng)的酯香味，而且口感均衡。

表3 添加紅棗汁對啤酒風(fēng)味物質(zhì)組成的影響Table 3 Effect of jujube juice supplementation on the composition of beer flavor substance

續(xù)表

3 結(jié)論

在啤酒高濃釀造過程中添加紅棗汁，可以提高發(fā)酵初期的發(fā)酵速率，更快的發(fā)酵速度能縮短發(fā)酵周期。添加紅棗汁能夠提高發(fā)酵結(jié)束時的麥汁發(fā)酵度及乙醇產(chǎn)量，其中，30%的紅棗汁添加量效果最好，發(fā)酵度及乙醇產(chǎn)量分別比對照組提高了4.16%和4.63%。添加紅棗汁可改變啤酒的顏色：L*值降低，a*值與b*值升高，即降低啤酒的亮度，并使啤酒呈現(xiàn)出更多的黃色與紅色，即表現(xiàn)出更多與紅棗相似的感官特性。紅棗汁的添加可有效降低啤酒醇酯比，使啤酒的口感更加均衡與柔和。