酸筍中高產乳酸乳酸菌的篩選、鑒定及發酵條件優化

吳錦蘭，付玉麟，周小玲，陳正培，熊建文*，崔 娜，鞏 僖

（柳州工學院 食品與化學工程系，廣西 柳州 545616）

酸筍作為我國傳統發酵食材，在南方地區一直被廣泛食用，具有悠久的歷史[1]。酸筍不僅富含膳食纖維和礦物質元素等營養保健物質，而且具有獨特的風味特征，朱照華[2]研究發現，酸筍中的揮發性風味物質高達53種，包含了酚類、醇類、醛類和酸類等風味成分，酸筍也因獨特的酸味受到人們的鐘愛。長期以來，酸筍的生產多為自然發酵，以竹筍為原料，利用自然附著微生物發酵制作而成，酸筍中蘊含著豐富的微生物資源[3]。相關研究表明[4-6]，傳統發酵食品中存在多種乳酸菌，這些乳酸菌不僅能改變發酵食品的風味、提高營養價值，而且還能進一步提高發酵食品的生理保健機能。

乳酸菌是一類能發酵糖類產生乳酸的革蘭氏陽性、不產芽孢的細菌總稱[7-10]。乳酸菌在發酵過程中能夠分泌產生乳酸等有機酸，不僅賦予食品柔和的酸味，刺激人的食欲、幫助消化，而且能夠有效降低發酵系統的pH值，形成適于乳酸菌生長的環境，縮短發酵周期，同時抑制不耐酸性腐敗菌的生長，延長食品保質期[11-13]。乳酸作為天然的有機酸，也被廣泛應用于食品、紡織業、化學和制造業中[14]。近年來，隨著對乳酸菌益生作用研究的不斷深入及乳酸需求量的逐步增加，傳統發酵食品中高產乳酸乳酸菌的篩選也已逐漸成為研究熱點。葛菁萍等[15]從酸菜發酵液中分離篩選得到一株高產乳酸的乳酸菌，經鑒定為干酪乳桿菌（Lactobacillus casei），該菌株被應用于有機酸發酵及酸菜發酵的酸化處理。

目前，有關酸筍的研究主要集中在營養成分、風味物質和制作工藝上[16-19]，而有關酸筍中功能性乳酸菌的研究鮮見報道。本研究以柳州傳統發酵酸筍為原料，采用MRS平板培養法對酸筍自然發酵液中的乳酸菌進行分離，結合溶鈣圈試驗和高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對高產乳酸乳酸菌進行篩選，隨后對該優良菌株進行分子生物學鑒定和發酵條件優化，以期為酸筍來源乳酸菌發酵產生乳酸的研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

酸筍自然發酵液：采集于廣西柳州的五個地區（柳南、柳北、柳城、城中、鹿寨）。

1.1.2 化學試劑

蛋白胨、牛肉浸膏、胰蛋白胨、細菌學蛋白胨、多聚蛋白胨、酵母粉（均為生化試劑）：廣東環凱微生物科技有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：北京奧博星生物技術有限公司；葡萄糖、蔗糖、乳糖（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；碳酸鈣、乙酸鈉、檸檬酸三銨（均為分析純）：廣東光華科技股份有限公司。

1.1.3 培養基

MRS液體培養基[21]：蛋白胨10.0 g/L，牛肉浸膏5.0 g/L，酵母粉4.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐溫-801.0mL，K2HPO42.0g/L，結晶乙酸鈉5.0 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L，MgSO2·7H2O 0.2 g/L，MnSO2·4H2O 0.05 g/L，pH值6.2。121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

MRS固體培養基[20]：向上述MRS液體培養基中加入瓊脂粉15 g/L，碳酸鈣1.0 g/L，pH值6.2。121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

LRH-150生化培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；SW-CJ-2F超凈工作臺：蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司；UV-1800型紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；L9800基因擴增儀：北京萊普特科學儀器有限公司；GenoSens1880凝膠成像分析系統：上海勤翔科學儀器有限公司；Nikon Eclipse E200光學顯微鏡：上海衡浩儀器有限公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離與純化

取柳州酸筍發酵液樣品，以無菌生理鹽水進行梯度稀釋（10-1～10-5）后涂布于MRS固體培養基，于37 ℃恒溫靜置培養24 h，挑取溶鈣圈明顯，表面光滑、中間隆起，白色或者乳白色的菌落，在MRS固體培養基上劃線分離，多次純化，經過革蘭氏染色和接觸酶反應后，挑選出革蘭氏陽性、接觸酶陰性菌株接種斜面、編號、保存備用。

1.3.2 高產乳酸乳酸菌的篩選

把分離得到的乳酸菌菌株接種到10 mL MRS液體培養基中，37 ℃、170 r/min條件下培養24 h，取10 μL發酵液置于含MRS固體培養基的牛津杯中，每個菌株設置3次重復，以空白MRS液體培養基為對照，37 ℃條件下靜置培養24 h，測量溶鈣圈直徑，篩選出幾株溶鈣圈較大的乳酸菌，保存備用。

將鈣溶圈較大的乳酸菌接種到10 mLMRS液體培養基中，37℃、170r/min條件下培養48h，取1mL發酵液，10000r/min離心2 min后取上清液，用0.22 μL濾膜過濾后進樣，利用HPLC法測定乳酸產量。

1.3.3 高產乳酸乳酸菌株的鑒定

形態觀察：按照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[21]的方法，觀察待測菌株的菌落和菌體形態特征。

分子生物學鑒定：將待測菌株接種于10 mL MRS液體培養基中，37 ℃、170 r/min條件下振蕩培養過夜后，采用脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒提取基因組，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取基因組的質量。將完整且純度高的基因組DNA適當稀釋作為DNA模板，采用16SrDNA通用引物1492R（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和16S 27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，將PCR擴增產物送至華大基因生物公司進行測序。測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中，利用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比對搜索，獲得最相近菌株的16S rDNA基因序列，用Clustalx1.8按照最大同源性的原則進行排序，采用MEGA6.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹，自舉法（bootstrap）對系統發育樹進行檢驗，重復1 000次。

1.3.4 高產乳酸乳酸菌發酵條件優化

用接種環挑取少許高產乳酸乳酸菌于10 mL MRS液體培養基中，37 ℃、170 r/min條件下振蕩培養12 h進行菌種活化后，取100 μL菌液于10 mL MRS液體培養基中，37 ℃、170 r/min條件下振蕩培養24 h后得到種子液。

接種量的確定：將高產乳酸乳酸菌的種子液分別按照0.2%、1.0%、1.8%、2.6%、3.4%（V/V）的接種量接種于MRS液體培養基中，37 ℃、170 r/min條件下振蕩培養24 h后取發酵液進行乳酸含量測定，考察不同接種量對菌株產乳酸能力的影響。

在此基礎上，依次考察pH值（4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、培養溫度（22 ℃、27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃、47 ℃）、培養時間（6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、36 h）、碳源種類（葡萄糖、蔗糖、乳糖）及氮源種類（蛋白胨、胰蛋白胨、細菌學蛋白胨、多聚蛋白胨）對菌株產乳酸能力的影響。

1.3.5 乳酸含量的測定

采用HPLC法測定乳酸含量[22]。HPLC條件：C18色譜柱，流動相為2.5 mmol/L NH4H2PO4（含1%甲醇）溶液（pH 2.5），流速為1 mL/min，檢測波長為210 nm，進樣體積為20 μL，分析時間24 min。

1.3.6 數據處理與統計

使用Excel 2013進行標準偏差分析，用T-test進行差異性分析，用Origin9.0軟件進行繪圖分析。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離

從酸筍發酵液中共分離得到144株乳酸菌，菌株的來源及編號見表1。

表1 酸筍發酵液中乳酸菌的分離結果Table 1 Isolation results of lactic acid bacteria from sour bamboo shoot fermentation liquid

2.2 高產乳酸乳酸菌的篩選

通過溶鈣圈法從144株乳酸菌中篩選得到10株鈣溶圈較明顯的乳酸菌，測定這10株乳酸菌的鈣溶圈直徑及乳酸產量，結果見表2。其中乳酸菌LB-1-23發酵液高效液相色譜圖見圖1。由表2可知，10株乳酸菌的鈣溶圈直徑均＞9 mm，其中乳酸菌LB-1-23的鈣溶圈直徑最大，為11.00 mm。10株乳酸菌的乳酸產量均＞10 g/L，其中乳酸菌LB-1-23的乳酸產量最高，達12.181 g/L，故選取菌株LB-1-23為高產乳酸乳酸菌，進行后續研究。

表2 乳酸菌的溶鈣圈直徑和乳酸產量Table 2 Calcium dissolving circle diameter and lactic acid production of lactic acid bacteria

圖1 菌株LB-1-23發酵液的高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography of fermentation liquid of strain LB-1-23

2.3 高產乳酸乳酸菌菌株的鑒定

菌株LB-1-23在MRS固體培養基上培養24 h后，菌落及細胞形態見圖2。由圖2可知，菌落呈圓形、乳白色、表面光滑、中央微凸起，細胞呈短桿狀、單個或成對存在，無芽孢，革蘭氏染色為紫色呈陽性。

圖2 菌株LB-1-23的菌落（a）及細胞（b）形態Fig.2 Colony (a) and cell (b) morphologies of strain LB-1-23

以菌株LB-1-23的基因組DNA為模板對其16S rDNA基因序列進行PCR擴增，PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果見圖3。

圖3 菌株LB-1-23的16S rDNA PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplification of strain LB-1-23

由圖3可知，PCR擴增產物堿基長度為1 500 bp，與預期結果相符，委托北京六合華大基因科技有限公司進行測序。將測序結果提交至NCBI的GenBank數據庫中進行BLAST比對搜索，選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA基因序列，采用MEGA6.0軟件的NJ法構建系統發育樹，結果見圖4。由圖4可知，菌株LB-1-23與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）聚于一支，親源關系最近，同源性為99%。結合形態學特征與分子生物學鑒定結果，鑒定菌株LB-1-23為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。

圖4 基于16S rDNA基因序列菌株LB-1-23的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain LB-1-23 based on 16S rDNA gene sequences

2.4 乳酸菌LB-1-23產乳酸發酵條件優化

2.4.1 不同接種量對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響

不同接種量對菌株LB-1-23發酵產乳酸的影響見圖5。由圖5可知，當接種量在0.2%～2.6%之間時，乳酸菌LB-1-23的乳酸產量隨著接種量的增大逐漸增大；當接種量為2.6%時，乳酸菌LB-1-23的產乳酸能力最佳，乳酸含量為11.19g/L；當接種量＞2.6%時，乳酸產量隨著接種量的增大逐漸減小。故乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的最佳接種量為2.6%。

圖5 不同接種量對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響Fig.5 Effect of different inoculum on lactic acid production by lactic acid bacteria LB-1-23 fermentation

2.4.2 不同pH值對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響

不同pH值對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響見圖6。由圖6可知，隨著pH值的升高，乳酸菌LB-1-2的乳酸產量呈先升高后降低的趨勢，當pH值為5.5時，乳酸菌LB-1-23的產乳酸能力最高，乳酸產量為12.08 g/L。故確定乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的最適pH值為5.5。

圖6 不同pH值對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響Fig.6 Effect of different pH on lactic acid production by lactic acid bacteria LB-1-23 fermentation

2.4.3 不同發酵溫度對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響

不同發酵溫度對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響見圖7。由圖7可知，隨著發酵溫度的升高，乳酸菌LB-1-23的乳酸產量呈先升高后降低的趨勢，當發酵溫度為32 ℃時，乳酸產量最高，為12.35 g/L。故確定乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的最適發酵溫度為32 ℃。

圖7 不同發酵溫度對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響Fig.7 Effect of different fermentation temperature on lactic acid production by lactic acid bacteria LB-1-23 fermentation

2.4.4 不同發酵時間對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響

不同發酵時間對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響見圖8。

圖8 不同發酵時間對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響Fig.8 Effect of different fermentation time on lactic acid production by lactic acid bacteria LB-1-23 fermentation

由圖8可知，隨著發酵發酵時間的延長，乳酸菌LB-1-23的乳酸產量呈先升高后降低的趨勢，當發酵時間為30 h時，乳酸產量最高，為12.53 g/L。故確定乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的最適發酵時間為30 h。

2.4.5 不同碳源對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響

不同碳源對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響見圖9。由圖9可知，當以葡萄糖為碳源時，乳酸產量最高為12.53g/L。改變碳源為蔗糖和乳糖時，乳酸菌LB-1-23的乳酸產量減小。故確定乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的最適碳源為葡萄糖。

圖9 不同碳源對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響Fig.9 Effect of different carbon sources on lactic acid production by lactic acid bacteria LB-1-23 fermentation

2.4.6 不同氮源對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響

不同氮源對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響見圖10。由圖10可知，當以細菌學蛋白胨為氮源時，乳酸產量最高為12.74 g/L。改變氮源為蛋白胨、胰蛋白胨、多聚蛋白胨時，乳酸菌LB-1-23的乳酸產量減小。故確定乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的最適氮源為細菌學蛋白胨。

圖10 不同氮源對乳酸菌LB-1-23發酵產乳酸的影響Fig.10 Effect of different nitrogen sources on lactic acid production by lactic acid bacteria LB-1-23 fermentation

3 結論

本研究從柳州酸筍發酵液中篩選得到一株高產乳酸的乳酸菌LB-1-23，經形態觀察及分子生物學鑒定，該菌株被鑒定為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），其產乳酸的最適發酵條件為接種量2.6%，pH值5.5，發酵溫度32 ℃，發酵時間30 h，葡萄糖為碳源，細菌學蛋白胨為氮源。在此優化條件下，乳酸產量達12.74 g/L。本研究篩選得到的植物乳酸菌LB-1-23，源于廣西發酵酸筍，且具有高產乳酸功能，有望作為直投式優良菌株應用于酸筍發酵中，對在工業上提升酸筍發酵工藝具有重要的指導意義。同時，拓展了發酵產乳酸的微生物菌株來源，為乳酸工業生產實踐提供一定的理論參考。