發酵馬肉香腸菌種配比的優化及模糊數學評價

嚴宏孟，徐楊林，伊力夏提·艾熱提，戴志偉，孔令明，周建中*

（新疆農業大學 食品科學與藥學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

馬肉是一種相比于牛、羊肉較低脂肪及膽固醇，而蛋白質含量以及不飽和脂肪酸含量相對較高的肉類[1-2]。食用馬肉能夠有效地促進血液循環、提高人體免疫能力，并且防止產生貧血等癥狀，堪稱食補中的佳品[3]。因馬肉中含有1%的糖原使得其具有一種獨特風味[4]。正是因為上述特點，使得馬肉逐步受到了大眾消費者的歡迎。發酵香腸是指由動物瘦肉與脂肪經絞肉機絞碎后加入香辛料腌制，隨后經過自然或人工添加發酵劑的條件下進行發酵，烘烤或煮至成熟[5-6]，具有特殊發酵風味[7]，良好的耐貯藏性的一類肉制品[8]。混合的發酵劑能夠起到互補作用，既能產酸[9]，又能提高發酵香腸產品品質和安全性[10]。現如今市面上大多是以牛肉、羊肉、豬肉為原料制作的發酵香腸，品種單一，對以馬肉為原料制作的發酵香腸研究甚少。

混料試驗設計[11-13]是將若干不同成分的元素重新組成新物品，是一種受特殊條件約束的回歸設計方法，只研究各個成分配制的比例，而與配制總量無關，相比于其他方法它能有效地減少試驗次數，在數據處理計算以及分析過程中較為簡易，同時具有快速得到最優配比結果等優勢[14]。這種方法廣泛應用于食品、工業、醫藥等方面[15]。安定等[16]研究利用了混料設計試驗優化了發酵酸奶中復配穩定劑的配方，得到了相對穩定的產品。依據GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評定標準》來進行感官評價，但其中不免有評定者自身主觀因素，造成一定的非準確性[17]，基于此現象運用模糊數學法將一些模糊概念或難以量化的事物用數學的方式來進行精密的計算，可填補傳統感官評價數據非定量化的漏洞[18]，從而實現對多因素影響產品感官的綜合評價。本試驗采用混料設計法，將馬肉發酵香腸按照一定配比調料腌制，隨后根據混料設計列表接種不同配比的菌種來進行混合發酵，試驗以發酵產總酸含量以及用模糊數學法去評價馬肉發酵香腸產品得出的分數作為指標對其進行綜合的評估，通過軟件分析得出產品風味最佳時菌種配比，為實現馬肉發酵產品的深加工以及規模化生產提供了一定的理論和創新性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬肉：新疆遠航食品有限公司；食用鹽、味精、胡椒粉、孜然粉、白砂糖、十三香、味精、姜粉、料酒：市售；亞硝酸鈉（分析純）：康迪斯化工（湖北）有限公司。

漢遜德巴利酵母菌（Debaryomyces hansenii）1808、木糖葡萄球菌（Staphylococcusxylose）21445：中國工業微生物菌種保藏管理中心提供；瑞士乳桿菌（Lactobacillushelveticus）B25、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）E11、保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus）：新疆農業大學微生物試驗室保存。

亞硝酸鈉、氯化鈉、氫氧化鈉（均為分析純）：東莞市喬科化學有限公司；MRS培養基、麥芽汁培養基、營養肉湯（瓊脂）培養基：北京奧博星生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

Binder KB系列生化培養箱：濟南鑫晟生物技術有限公司；AVC-4D1超凈工作臺：河南兄弟儀器設備有限公司；GF29DA高壓滅菌器：北京天賜科儀商貿有限公司；101-2電熱恒溫鼓風干燥箱：紹興市景邁儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 馬肉發酵香腸的工藝流程及操作要點

工藝流程：馬肉預處理→接種與腌制→灌腸→浸洗→靜置→發酵→烘烤→蒸煮→包裝

基本配方：原料肉100 g，料酒0.5 g，白糖5 g，食鹽2.2 g，孜然粉0.23 g，白胡椒粉0.1 g，五香粉0.2 g，十三香0.5 g，味精0.1 g，姜粉0.3 g，白胡椒粉0.1 g，孜然粉0.23 g，亞硝酸鹽100 mg/L，大豆分離蛋白2 g。

操作要點：將原料馬肉的瘦肉絞碎，脂肪切成1 cm3大小，按照肥瘦比2∶8進行均勻混合，加入白糖、食鹽、香辛料腌制30 min，溫度設為4 ℃，隨后加入混合發酵劑與餡料充分接觸混合，再在無菌狀態下灌腸，肉與腸衣盡量貼緊，并用無菌水擦拭干凈腸衣表面油脂和雜質，隨后用無菌針扎孔排出多余的氣體，30 ℃恒溫培養箱發酵20 h，制備的香腸在65 ℃烘烤條件下2 h后終止發酵，隨后在蒸煮鍋中水燒開的條件下蒸煮20 min，將產品包裝在真空壓縮袋中。

1.3.2 乳酸菌菌種選擇試驗

將活化好的3株乳酸菌按照2%的接種量分別接種到未添加白糖、食鹽、香辛料的純馬肉肉糜中（模擬馬肉香腸發酵環境），在37 ℃恒溫箱中培養18 h后加無菌蒸餾水稀釋肉糜并攪拌過濾，將樣品液體稀釋涂布于固體培養基中培養，測定最終馬肉肉糜的活菌數和總酸含量，結合兩個指標最終選出1株發酵性能較好的菌株。

1.3.3 菌種拮抗試驗

用接種環挑取3株菌株的單菌落，兩兩依次交叉劃線于營養瓊脂培養基平板上進行拮抗試驗。試驗的培養溫度設為37 ℃，時間設定為15 h，待長出菌落后，觀察三種菌株劃線的交叉處是否生長菌落，假如試驗菌落不能在兩菌落交叉處生長，說明菌間有拮抗作用；假如試驗菌能在兩菌落交叉處生長則說明菌間無拮抗，可用于馬肉香腸的發酵，為進一步試驗打下基礎。

1.3.4 菌種的耐鹽馴化試驗

參考趙強等[19]的方法略作改動，首先稱取10 g馬肉制備成無香辛料以及鹽類的馬肉香腸樣品浸提液（全過程均在無菌環境下進行操作），將浸提液作為菌種生長的液體培養基，內部均加入質量濃度為100 mg/L的亞硝酸鈉，隨之添加不同梯度濃度（0%、1%、3%、5%）的NaCl，滅菌冷卻備用。吸取對數生長期菌液以1%加入0%NaCl濃度的液體培養基中，在37 ℃的環境中培養24 h（酵母菌30 ℃、48 h）后進行菌落測定，菌落總數在108CFU/mL以上時，即可斜面保存，再次活化進行下一梯度的培養，并且培養直至總菌落數達到108CFU/mL為止，進行儲存，為下一步試驗做準備。

1.3.5 菌株混料設計試驗

選取3株發酵性能較好的菌株，使用馴化試驗培養至濃度不低于1×108CFU/mL的菌種接種于已添加白糖、食鹽、香辛料的馬肉餡料中，接種量為2%，灌腸后在發酵溫度30 ℃條件下培養20 h，并以Design-Expert 12.0中Mixture的Simple centroid來進行試驗設計，以產品發酵產生的總酸含量和模糊數學法得到的感官評分作為響應值，進行數據分析，得到最佳優化發酵菌種的配比。

1.3.6 建立模糊數學模型

試驗以產品的色澤、氣味、組織狀態、滋味為因素集U=（色澤U1、氣味U2、組織狀態U3、滋味U4），以優、良、中、差為評語集V=（優V1，良V2，中V3，差V4）[20-21]，得分設計80～100分為優，60～80分為良，40～60分為中，20～40分為差。設置權重集為X={0.2，0.2，0.1，0.5}，其中分別代表顏色20分，氣味20分，組織狀態10分，滋味50分，合計100分。模糊關系評價集Y=XR（R為評價的次數除以k，k=10）。最后引入綜合評分矩陣T來對評價Y進行處理，因感官評價具有一定差異性，所以取中間量，設置評價等級集K=｛k1=90，k2=70，k3=50，k4=30｝，最終得到馬肉發酵香腸的模糊綜合評價總分T=Y×K。

感官評定標準：隨機選擇10位食品專業研究生作為感官評分成員，按照GB/T 22210—2008《肉與肉制品感官評定標準》進行培訓，小組成員要求對所有樣品進行評分。感官評分標準見表1。

表1 發酵馬肉香腸感官評定標準Table 1 Sensory evaluation standards of fermented horse meat sausage

續表

1.3.7 理化指標檢測

活菌數測定：根據GB 4789.2—2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》[22]，利用稀釋涂布的菌落計數方法，將涂布后的培養皿置于37 ℃或30 ℃（依據不同菌種培養條件進行選擇），培養24 h。

總酸測定：參考GB/T 12456—2008《食品中總酸測定》。

1.3.8 數據處理

運用IBM-SPSS 19和Design-Expert 21.0軟件對試驗數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 發酵乳酸菌菌種選擇

三種不同乳酸菌在馬肉香腸發酵過程中所產生的總酸含量和總活菌數如表2所示。由表2所知，三種乳酸菌發酵的總活菌數均能夠達到108CFU/mL，總酸含量均＞6 g/kg。這是由于微生物在發酵過程中以馬肉香腸中還原糖為繁殖生長的底物能夠產出酸性物質。其中植物乳桿菌E11總活菌數以及總酸含量最高，分別為4.27×108CFU/mL、6.68 g/kg，均顯著高于其他兩種菌種（P＜0.05）。由于要選擇優勢菌種，能夠充分的利用馬肉中糖類物質進行發酵，得到優質的馬肉產品，所以最終本試驗所用乳酸菌為植物乳桿菌E11。

表2 不同乳酸菌發酵馬肉香腸的總酸含量和總活菌數Table 2 Total acid content and total viable counts of fermented horse meat sausage with different lactic acid bacteria

2.2 拮抗試驗結果

圖1 菌種拮抗試驗結果Fig.1 Experimental results of strain antagonism

如圖1所示，漢遜德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445、植物乳桿菌E11兩兩劃線交叉點處菌落生長繁殖狀況良好，菌落間沒有出現抑制兩者周圍菌落生長的情況，不存在拮抗作用。表明三種菌種彼此之間可在發酵過程中進行正常發酵，并發揮菌種自身優勢，可發酵出品質更加優越的產品。

2.3 菌種的耐鹽馴化試驗結果

植物乳桿菌E11、漢遜德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445馴化結果見表3～表5。

表3 植物乳桿菌E11耐鹽馴化試驗結果Table 3 Domestication of Lactobacillus plantarum E11 salt tolerance

表4 木糖葡萄球菌21445耐鹽馴化試驗結果Table 4 Domestication of Staphylococcus xylose 21445 salt tolerance

表5 漢遜德巴利酵母菌1808耐鹽馴化試驗結果Table 5 Domestication of Debaryomyces hansenii 1808 salt tolerance

2.4 混料設計優化結果

本試驗將A（漢遜德巴利酵母菌1808）、B（木糖葡萄球菌21445）和C（植物乳桿菌E11）3個因素設為自變量，以2%接種量接種至馬肉肉餡中，灌腸發酵，30 ℃恒溫培養條下發酵20h，將發酵后的總酸含量和感官評分作為響應值，運用Design-Expert 12.0軟件中的Mixture的Simple centroid進行數據分析，混料設計試驗方案及結果見表6，通過10名感官評價人員在相同實驗條件下對16組馬肉發酵香腸樣品進行評價，得出的模糊數學感官評價結果見表7。

表6 不同菌種配比發酵馬肉香腸優化試驗設計及結果Table 6 Design and results of different strain ratio optimization tests for fermented horse meat sausage

表7 不同菌種配比發酵馬肉香腸的感官評價結果Table 7 Sensory evaluation results of fermented horse meat sausage with different strain ratios

2.5 總酸含量和感官評分模型的建立及方差分析

此試驗結果的二次多項回歸擬合是通過Design-Expert 12軟件得到的，對總酸含量（Y1）和感官評分（Y2）分別進行回歸模型的建立，回歸模型方程分別如下：

Y1=-0.844 9A+9.40B+5.95C+8.72AB+26.77AC+11.73BC

Y2=77.72A+52.52B+97.32C+54.45AB-15.95AC+43.25BC

總酸含量方差分析結果見表8。由表8可知，該試驗模型具有顯著性（P＜0.000 1），失擬項呈顯著（P=0.000 5）。預測的R2值為0.937 5，這與調整后的R2值0.944 1大體上基本保持一致，能夠說明此模型具有較好的擬合發酵馬肉香腸總酸含量和菌種配比之間的關系。通過F值和P值可知，3個因素之間具有顯著交互作用，對于總酸含量作用大小順序依次為AC＞BC＞AB，代表A（漢遜德巴利酵母菌1808）、C（植物乳桿菌E11）兩者交互作用對香腸的發酵產酸具有較大影響。其他兩組組合之間交互作用次之。

表8 以總酸含量為響應值的方差分析結果Table 8 Results of variance analysis using total acid content as response value

感官評分方差分析結果見表9。由表9可知，該試驗模型也同樣具有顯著性（P＜0.000 1），失擬項顯著（P=0.002 7）。預測的R2值為0.961 4，這與調整后的R2值0.972 3基本保持一致，能夠很好的說明此模型有較好擬合發酵馬肉香腸感官評分和菌種配比間的關系。通過表格F值和P值可知，3個因素之間具有顯著交互作用，對于感官評分數值影響大小的順序依次為AB＞BC＞AC，代表A（1808漢遜德巴利酵母菌）、B（21445木糖葡萄球菌）兩者交互作用對香腸的感官評分具有較大影響。其他兩組組合之間交互作用次之。

表9 以模糊數學感官評分為響應值的方差分析結果Table 9 Results of variance analysis using fuzzy mathematics sensory score as response value

2.6 總酸含量和活菌數模型交互項的響應曲面圖分析

圖2 漢遜德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445、植物乳桿菌E11交互作用對產品總酸含量（A）、模糊數學感官評分（B）影響的響應曲面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between Debaryomyces hansenii 1808, Staphylococcus xylose 21445 and Lactobacillus plantarum E11 on total content (A) and fuzzy mathematics sensory score (B) of products

混料試驗中，三元的等高線和響應面曲線圖能夠較為直觀的體現出各因素在一定條件下的變化趨勢和兩兩因素之間的交互作用對響應值總酸含量、感官評分的影響。3個因素交互作用對總酸含量、模糊數學感官評分的影響見圖2，響應面呈曲面圖說明三株菌落之間具有交互作用，其中C（植物乳桿菌E11）對于總酸含量變化影響最大，當其水平為0.75時，總酸量達到最大10.66 g/kg，而A（漢遜德巴利酵母菌1808）、B（木糖葡萄球菌21445）對總酸量也有較為顯著的影響。C（植物乳桿菌E11）同樣對感官評分影響作用也最大，當數值達到0.5時，感官評分值為最高（88分），說明該水平酸味程度是可以被接受的，同時香腸整體綜合評價也較高，其他兩種菌對其影響程度較弱。

2.7 發酵劑配比優化及驗證試驗

運用軟件最優化功能來進行菌種配比優化試驗以及驗證試驗，并設定所需最高響應值，運行軟件后，在給定因素范圍內隨機組合若干組菌種配比并預測數值，最終不斷趨近于理想響應值，如表10所示，根據試驗實際情況以及是否易于操作等因素選出漢遜德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445與植物乳桿菌E11以0.75∶0.75∶0.50配比組合，該試驗條件下，總酸含量、感官評分分別為10.57 g/kg、88.039分，為證明軟件預測結果的可行性，此組合進行3次重復試驗進行驗證，平均總酸含量為10 g/kg，平均感官評分為88.05分，二者良好的擬合性說明了模型預測可行性，結果并無明顯差異，說明此軟件進行的菌種配比優化具有現實性意義。

表10 各菌種最佳組合及預測結果Table 10 Optimal combinations of various strains and prediction results

3 結論

本試驗以總活菌數和總酸量為指標，通過菌種選擇試驗確定了發酵乳酸菌菌種為植物乳桿菌E11，并將其與漢遜德巴利酵母菌1808、木糖葡萄球菌21445交叉劃線，三種菌種間無拮抗作用，運用模糊數學法得到不同配比菌種發酵香腸的感官評分，利用軟件混料設計優化菌種配比，最終選擇菌種最優配比為漢遜德巴利酵母菌1808∶木糖葡萄球菌21445∶植物乳桿菌E11=0.75∶0.75∶0.50（V/V）。馬肉產品在此菌種配比水平時平均總酸含量為10 g/kg，平均感官評分為88.05分。腸體表面呈明亮棗紅色，具有純正濃郁的發酵氣味及酸味，切面肉餡緊實，界面清晰，能夠適宜廣大消費者口味，具有普遍接受性，混合發酵劑的應用也為馬肉發酵產品的開發提供新的理論支撐。