泡桐花總黃酮的提取工藝優化及抗氧化活性

呂亭亭，楊志華，陶 娟，韓永紅，蔡亮亮，葉翩翩，劉 旭*

（1.江蘇護理職業學院 藥學與中藥學院，江蘇 淮安 223005；2.天津中醫藥大學 第一附屬醫院，天津 300381；3.南通大學 附屬醫院，江蘇 南通 226001）

泡桐（Paulownia fortunei）屬于雙子葉植物綱中的玄參目玄參科，其資源豐富，分布廣泛，種類繁多，常見的有毛泡桐、蘭考泡桐、白花泡桐等種類，在黃河流域被用作傳統醫藥數百年[1]。近年來研究發現，泡桐花主要含有總黃酮類、多糖、萜類、生物堿、有機酸、氨基酸等活性成分[2-3]，具有清熱解毒、疏風散熱、燥濕止痢、清肝明目之功能[4-5]，多用于治療慢性支氣管炎、肺炎等疾病[6]。目前，對泡桐的研究主要集中在栽培技術和幼苗培育技術上，而對有效部位泡桐花的研究主要集中在提取分離黃酮類、多糖、多酚，熊果酸等有效成分，研究其最佳提取工藝及藥理作用，為工業化生產及開發應用于臨床提供一定的參考依據。

研究發現，黃酮類物質具有抗炎[7]、抗腫瘤[8]、抗氧化[9]、抗病毒[10]、降血糖[11]等藥理作用，在食品和制藥行業應用廣泛。泡桐花黃酮的常用提取方法有溶劑回流提取法、微波提取和超聲波提取法，張青青等[12-13]采用乙醇加熱回流法提取工藝泡桐花總黃酮，該種提取方法提取溫度穩定，利于總黃酮類物質溶出，但是溶劑消耗量大、耗時耗能、提取率低。孟志芬等[14-15]分別采用微波法和超聲法提取泡桐花總黃酮，這兩種提取方法相較于回流提取法具有操作簡單、提取效率高且提取時間短的優點。本試驗擬采用超聲輔助纖維素酶法提取泡桐花總黃酮，在單因素試驗的基礎上，結合響應面法對泡桐花總黃酮提取工藝參數進行優化，并對其體外抗氧化能力進行研究，以期為開發天然抗氧化劑應用于功能性食品、化妝品及制藥行業提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泡桐花：購自河南蘭考的中草藥市場，經鑒定屬于玄參科泡桐屬植物。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、纖維素酶（酶活力20 U/mg）：南京奧多福尼生物科技有限公司；蘆丁（純度＞98%）、抗壞血酸、2,2'-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（diammonium 2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS）（均為分析純）：上海如吉生物科技發展有限公司；過硫酸鉀、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

HX-200A多功能粉碎機：中國永康市五金醫療器械廠；UV1800紫外檢測器：日本島津有限公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋：國華電器有限公司；BSA電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；PS-60型超聲波清洗器：蘇州市創惠電子有限公司；PHS-25精密酸度計：上海精密儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

泡桐花樣品干燥至恒質量，用多功能粉碎機粉碎成300目，收集，保存備用。

1.3.2 泡桐花總黃酮提取工藝

依照超聲波輔助酶法提取泡桐花總黃酮[16]：

稱取泡桐花粉末→添加pH4.5醋酸-醋酸鈉緩沖液→按照1.0 mg/g加入纖維素酶→45 ℃酶解30 min→滅酶（80 ℃，10 min）→加入體積分數為60%乙醇溶液→超聲處理→離心（4 000 r/min，10 min）→上清液過濾濃縮

1.3.3 泡桐花總黃酮含量的測定

參照文獻[17]，采用硝酸鋁法繪制標準曲線，取蘆丁對照品5.0 mg，置于25 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，配成0.20 mg/mL的對照品溶液。精密量取對照品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，依次加入0.3 mL 5%NaNO2，搖勻，靜置6 min，再各加0.3 mL 10%Al（NO3）3，搖勻，靜置6 min，各加3.0 mL 1.0 mol/L NaOH溶液，用蒸餾水定容至10 mL，放置15 min，以空白試劑作為參比，于510 nm波長處測定吸光度值。蘆丁標準曲線回歸方程為：y=9.315x-0.035 3，相關系數R2=0.999 8。

取適量樣品，配制成一定質量濃度的溶液，按上述方法測定總黃酮含量，重復3次，按照式（1）計算總黃酮得率。

式中：Y為泡桐花總黃酮提取得率，%；C為提取液中總黃酮的質量濃度，mg/mL；V為提取液定容體積，mL；D為稀釋倍數；m為泡桐花樣品稱取質量，g。

1.3.4 泡桐花總黃酮提取條件優化單因素試驗

分別考察纖維素酶的用量（0.5 mg/g、1.0 mg/g、1.5 mg/g、2.0 mg/g、2.5 mg/g）、酶解溫度（40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃）、酶解時間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）、pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）、液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL∶g））、乙醇體積分數（40%、50%、60%、70%、80%）、超聲功率（100 W、150 W、200 W、250 W、300 W）和超聲時間（13 min、16 min、19 min、22 min、25 min）對總黃酮產率的影響，每個水平平行測定3次，取平均值。

1.3.5 響應面試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，選擇對總黃酮提取得率影響較大的4個因素，酶解溫度（A）、超聲功率（B）、液料比（C）和酶解時間（D）進行Box-Benhnken試驗設計，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 黃酮提取工藝優化響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for flavonoid extraction process optimization

1.3.6 泡桐花總黃酮抗氧化活性研究

（1）泡桐花總黃酮對DPPH自由基清除率的測定

提取的泡桐花總黃酮用無水乙醇配成質量濃度為50 μg/mL、70 μg/mL、90 μg/mL、110 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、500 μg/mL、800 μg/mL的樣品溶液，根據文獻[18]的試驗方法測定總黃酮的抗氧化活性。以抗壞血酸作為對照，按式（2）計算清除率及半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值。

式中：A0為無水乙醇和DPPH乙醇溶液混合均勻后吸光度值；A1為泡桐花樣品溶液與DPPH乙醇溶液混合均勻后吸光度值；A2為泡桐花樣品溶液與無水乙醇混合均勻后吸光度值。

（2）泡桐花總黃酮對羥自由基（·OH）清除活性的測定

參照文獻[19]的試驗方法并稍作修改，分別量取已配制質量濃度不同的樣品溶液與抗壞血酸對照品溶液各1.0 mL置于10mL容量瓶中，分別加入5mmol/L的水楊酸溶液1.0mL、5 mmol/L的FeSO4溶液1.0 mL，搖勻，使之充分混合，再加入5 mmol/L的H2O21.0 mL，蒸餾水定容至刻度，于37 ℃水浴放置30 min后，冷卻，在波長510 nm處測定吸光度值A1，用1.0 mL蒸餾水代替樣品溶液反應，按同樣的方法測定吸光度值A0，用1.0 mL蒸餾水代替H2O2，按同樣的方法測定吸光度值A2。按式（3）計算清除率及IC50。

式中：A0為不加樣品溶液的吸光度值；A1為加樣品溶液的吸光度值；A2為不加H2O2的吸光度值。

（3）泡桐花總黃酮對ABTS·清除活性的測定

參照文獻[20]的試驗方法并稍作修改，將配制好的7 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L的過硫酸鉀溶液按照1∶1的比例混合均勻，室溫避光放置12 h，制成ABTS儲備液。使用前用無水乙醇稀釋使其在734 nm的吸光度值為0.7～0.8。

農田排水溝道滲濾是一個自然過程，包括溝坡滲濾和溝底滲濾。滲濾系統對溝道水體中的污染物會發生物理、化學及生物作用，使溝道水體入滲后水質得到大大的改善和凈化。在考慮滿足穩定性和排水特性要求的前提下，在示范區試驗地塊設置了兼顧溝道穩定性、排水效果、植物生長條件的農田滲濾溝道梯形結構形式(見圖1)。

分別量取已配制質量濃度不同的樣品溶液與抗壞血酸對照品溶液各0.4 mL，加入4.0 mL ABTS儲備液，充分混勻，在室溫下避光反應8 min，測定波長734 nm處吸光度值A1，0.4 mL乙醇代替樣品溶液與4.0 mL ABTS儲備液混合，測定吸光度值A0，0.4 mL樣品溶液與4.0 mL乙醇混合，測定吸光度值A2。按式（4）計算清除率及IC50。

式中：A0為不加樣品溶液的吸光度值；A1為加樣品溶液的吸光度值；A2為不加ABTS的吸光度值。

1.3.7 數據處理

使用Design-Expert 8.0.6、OriginPro 2016、SPSS 22.0軟件進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 泡桐花總黃酮提取工藝優化單因素試驗

纖維素酶用量、酶解溫度、酶解時間、pH、液料比、乙醇體積分數、超聲功率、超聲時間對總黃酮得率的影響見圖1。

圖1 纖維素酶用量（a）、酶解溫度（b）、酶解時間（c）、pH（d）、液料比（e）、乙醇體積分數（f）、超聲功率（g）、超聲時間（h）對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of cellulase dosage (a),enzymolysis temperature (b),enzymolysis time (c),pH (d),liquid-solid ratio (e),ethanol volume fraction (f),ultrasonic power (g),ultrasonic time (h) on the yield of total flavonoids

如圖1a所示，隨著纖維素酶的增加，總黃酮提取得率先升高后降低，這可能是因為細胞壁是由纖維素構成，纖維素酶添加量為1.0 mg/g時，細胞壁纖維素水解較徹底，促進總黃酮從細胞中溶出，當纖維素酶添加量繼續增大時，會抑制酶的活力，導致總黃酮提取得率降低，因此選擇酶添加量1.0 mg/g較為適宜。由圖1b可以得出，當酶解溫度為50 ℃時，總黃酮得率最大，可能是50 ℃時酶的活力達到最大，溫度過低時，酶未被完全活化，不能充分發揮水解的作用，當溫度過高時，酶的活性受到抑制，因此選擇50 ℃為最佳酶解溫度。由圖1c可見，總黃酮的得率隨著酶解時間的延長呈現先升高后降低的趨勢，說明在40 min時，酶解效果較好，低于40 min時，纖維素酶未能完全水解細胞壁，導致總黃酮未能充分溶出，高于40 min時，可能會導致部分黃酮分子結構遭到破壞，還會促使其他非黃酮類物質的溶出，導致總黃酮得率降低，因此，適宜的酶解時間為40 min。如圖1d所示，隨著pH的增加，總黃酮得率呈現先增后減的趨勢，但變化不大，應選擇5.5為最佳的pH。如圖1e所示，液料比30∶1（mL∶g）時，總黃酮得率最大，當液料比大于30∶1（mL∶g），總黃酮提取得率降低。可能是因為液料比過大時，提取溶劑較大會加大其他雜質的溶出，致使降壓濃縮過程延長，會使部分總黃酮降解，使得提取率下降。因而選擇液料比30∶1（mL∶g）較為適宜。由圖1f可知，當乙醇體積分數為60%時，泡桐花總黃酮得率最大，這可能是因為乙醇體積分數太低，未能將泡桐花中的總黃酮完全浸出，而濃度太大時，醇溶性雜質又開始析出，導致總黃酮得率下降[21-22]。故選用乙醇體積分數60%較為適宜。由圖1g可知，超聲功率為200 W時，總黃酮提取得率達到最大，可能原因是功率較大時，超聲波及剪切力作用下，使得總黃酮的結構遭到破壞，造成總黃酮得率下降[23]，故選用200 W為最佳的超聲功率。由圖1h可知，當超聲時間16 min時，總黃酮得率達到最大，這可能是因為超聲時間超過30 min，總黃酮類物質可能會發生降解，導致得率下降[24]，故選用16 min為最佳的超聲時間。

2.2 泡桐花總黃酮提取工藝優化響應面試驗

2.2.1 響應面試驗結果及分析

表2 黃酮提取工藝優化響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface tests for flavonoid extraction process optimization

運用Design-Expert 8.0.6軟件對表2結果進行回歸擬合，所得二次回歸方程為：Y=7.82-0.44A+0.18B+0.093C-0.24D+0.57AB+0.0025AC-0.15AD+0.43BC-0.11BD-0.027CD-0.43A2-0.48B2-0.16C2-0.42D2。回歸方程方差分析如表3所示。

表3 響應面試驗二次模型方差分析Table 3 Variance analysis of response surface quadratic model

由表3可知，總模型P＜0.000 1，可知本試驗所選取的模型具有高度的顯著性，失擬項P值為0.308 8＞0.05，故失擬項不顯著，說明模型選取是無誤的；模型的決定系數R2=0.980 4，模型可以解釋98.04%實驗中總黃酮得率的變化，說明方程的擬合度較好。模型的調整決定系數R2=0.960 8，表明試驗誤差小，可用該模型進行試驗預測。因素A、B、D、AB、BC、A2、B2、C2、D2對試驗結果的影響極顯著（P＜0.01），因素C、AD對試驗結果的影響顯著（P＜0.05），由F值可知，各因素對總黃酮得率的影響主次順序為：酶解溫度（A）＞酶解時間（D）＞超聲功率（B）＞液料比（C）。

2.2.2 響應面圖分析

各因素對泡桐花總黃酮得率影響的響應面圖如圖2所示，響應曲面圖中圖形陡峭程度越大代表相互作用越大，反之則越小。觀察響應面的陡峭程度可以看出，酶解溫度對泡桐花總黃酮提取得率影響最大，其次是酶解時間、超聲功率，影響最小的是液料比，這與表3分析結果一致。

圖2 各因素交互作用對泡桐花總黃酮得率影響的響應面和等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the yield of flavonoids in Paulownia fortunei flowers

2.2.3 提取工藝優化及驗證試驗

通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得到最佳工藝條件為：酶解溫度50.13 ℃，超聲功率243.74 W，液料比40∶1（mL∶g），酶解時間35.89 min，在此優化提取條件下，總黃酮得率預測值可達8.01%。為便于試驗操作，將最佳提取工藝條件修正為：酶解溫度50 ℃，超聲功率240 W，液料比40∶1（mL∶g），酶解時間36 min，并在此優化提取條件下進行3次平行試驗的驗證，得到泡桐花總黃酮的平均得率實際值為7.82%，與預測值接近，表明該模型具有較好的預測性能，響應面法優化泡桐花總黃酮提取工藝具有可行性。

2.3 泡桐花總黃酮抗氧化活性研究

2.3.1 泡桐花總黃酮對DPPH·清除活性的測定

圖3 不同質量濃度的泡桐花總黃酮和抗壞血酸對DPPH自由基的清除活性Fig.3 Scavenging activities of different concentrations of Paulownia fortunei flowers total flavonoids and ascorbic acid on DPPH radical

不同質量濃度的泡桐花總黃酮和抗壞血酸對DPPH自由基的影響見圖3。如圖3所示，泡桐花總黃酮具有清除DPPH·的能力，且泡桐花總黃酮對DPPH·的清除率隨著質量濃度的增加而增大，最后趨于平衡，在質量濃度800μg/mL時，DPPH·清除率達到83.1%。由SPSS22.0軟件得出，泡桐花總黃酮的IC50值為214.2 μg/mL，抗壞血酸的IC50值為72.6 μg/mL，說明相同質量濃度下泡桐花總黃酮對DPPH·的清除率弱于抗壞血酸。

2.3.2 泡桐花總黃酮對·OH清除活性的測定

不同質量濃度的泡桐花總黃酮和抗壞血酸對羥自由基的影響見圖4。如圖4所示，泡桐花總黃酮具有清除羥的能力，且隨著質量濃度的增加，泡桐花總黃酮對羥的清除率先升高，最后趨于平衡，在質量濃度800 μg/mL時，清除率達到75.4%。泡桐花總黃酮的IC50值為200.7 μg/mL，與此同時抗壞血酸的IC50值為68.6 μg/mL，說明相同質量濃度下泡桐花總黃酮對·OH的清除能力弱于抗壞血酸。

圖4 不同質量濃度的泡桐花總黃酮和抗壞血酸對羥自由基的清除活性Fig.4 Scavenging activities of different concentrations of Paulownia fortunei flowers total flavonoids and ascorbic acid on OH radical

2.3.3 泡桐花總黃酮對ABTS·清除活性的測定

不同質量濃度的泡桐花總黃酮和抗壞血酸對ABTS自由基的影響見圖5。如圖5所示，泡桐花總黃酮具有清除ABTS·的能力，在質量濃度800 μg/mL時，清除率達到64.3%。由SPSS22軟件得出，泡桐花總黃酮的IC50值為328.5 μg/mL，抗壞血酸的IC50值為100.1 μg/mL，說明相同濃度下抗壞血酸對ABTS·的清除能力強于泡桐花總黃酮。

圖5 不同質量濃度的泡桐花總黃酮和抗壞血酸對ABTS自由基的清除活性Fig.5 Scavenging activities of different concentrations of Paulownia fortunei flowers total flavonoids and ascorbic acid on ABTS radical

3 結論

本試驗采用超聲波輔助酶法提取泡桐花總黃酮，在單因素試驗的基礎上，采用響應面法優化泡桐花總黃酮的提取工藝。優化后的最佳提取條件為酶解溫度50 ℃，超聲功率240 W，液料比40∶1（mL∶g），酶解時間36 min，通過3次平行試驗驗證得到泡桐花總黃酮的平均提取得率為7.82%，與預測值8.01%接近，表明該模型擬合度較好，為泡桐花總黃酮類化合物工業化生產提供一定的參考依據。泡桐花總黃酮抗氧化活性研究表明，泡桐花總黃酮對DPPH·、·OH和ABTS·均具有明顯的清除活性，未來可能被開發為一種新型的抗氧化劑應用在食品、藥品及化妝品等領域。在此基礎上，后續可以對泡桐花總黃酮體內抗氧化活性及抗氧化活性機理進行深入研究。