益生菌發酵南瓜漿的研究

彭興興

（1.江門職業技術學院 材料技術系，廣東 江門 529030；2.廣東省綠色高性能新材料研發工程技術研究中心，廣東 江門 529030）

南瓜是一種葫蘆科蔓性植物，其營養豐富，含有人體所需的氨基酸、多糖、類胡蘿卜素、礦質元素等營養物質，具有輔助降血脂、輔助降血糖、抗腫瘤、抗氧化等多種藥用價值[1-5]。根據聯合國糧食及農業組織統計數據庫，2014年我國南瓜總產量超過3 000萬t，生產面積110萬hm2，南瓜資源十分豐富[6]。益生菌廣泛存在于自然界中，是一類可以利用碳水化合物發酵產生大量乳酸的細菌總稱[7]。益生菌具有調節胃腸道菌群平衡，改善人體消化吸收系統，降低膽固醇等生物保健功能[8-11]。現今，發酵果蔬汁飲料發展迅猛[12-13]，已有多款同類產品上市，并且深得廣大消費者青睞，如豆樂奇。由于各種微生物胞內的酶系統是不同的，代謝途徑和產物也不同，對環境的生存適應能力也各不同，存在明顯的生理特性差異，而這些最終將影響到食品的風味和口感[14]。開發功能性益生菌發酵飲品，可以提高南瓜的精深加工附加值，豐富南瓜的產品形式。因此，從眾多微生物中篩選出比較適用于南瓜發酵的菌種就顯得特別有意義。本實驗以南瓜為原料進行發酵，結合活菌數、產酸速率、風味和口感等方面對產品進行評價，篩選出適用于南瓜漿發酵的菌株，為開發營養價值較好的發酵南瓜產品提供一定技術借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜜本南瓜：市售；瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus，LH），腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides，LM），嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，LA），鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnose，LR）：來自本實驗室；MRS固體培養基：廣州環凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SZX超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；WH-2微型渦流混合儀：上海瀘西分析儀器廠；pHS-25型酸度計：上海精密科學儀器有限公司；JY2002型電子天平：上海舜宇恒平科學儀表公司；Genex移液器：寶予德（中國）有限公司；YX-280高壓滅菌鍋：上海三申醫療器械有限公司；PYX-DHS隔水式保溫箱：上海博泰實驗設備有限公司；JMS-500膠體磨：廊坊市廊通機械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標測定

pH值：采用pHS-25型pH計進行測定；可滴定酸度：參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》；活菌數：參考GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》，采用平板計數法測定；還原糖：參考GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》，采用直接滴定法，每個樣品平行測定3次。

1.3.2 感官評價

參考文獻[15]，并作適當修改，選擇評分人員10人對發酵南瓜漿進行打分，滿分5分，結果取平均值，感官評分標準見表1。

表1 發酵南瓜漿感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standards of fermented pumpkin pulp

1.3.3 南瓜漿發酵工藝流程及操作要點

南瓜→清洗→去皮、去囊→切片→打漿→滅菌→冷卻→接種→發酵→成品

南瓜漿的制備：選擇成熟度高的新鮮南瓜，用清水沖洗后，先將南瓜去皮去囊，然后切成條狀，之后再切成片狀；按照南瓜∶水=1∶1（g∶mL）的料液比進行打漿，過膠體磨至果肉無明顯顆粒。取100 mL分裝于250 mL經滅菌處理的潔凈錐形瓶中，硅膠塞密封，制備32瓶。

南瓜漿加熱殺菌：在90～95 ℃、10～15 min的條件下進行滅菌處理，以殺滅南瓜漿中有害微生物。

接種、發酵：將滅菌后的南瓜漿冷卻至37 ℃左右，于無菌操作臺分別接種LA、LM、LH、LR各8瓶，初始活菌數控制為106CFU/mL，在37 ℃恒溫條件下發酵48 h。

2 結果與分析

2.1 各菌種在南瓜漿發酵過程中活菌數的變化

根據文獻資料[16-17]和實驗室條件，選擇LA、LM、LH和LR這4種單菌菌株在相同的條件下發酵南瓜，并進行對比分析。從接種開始計為0 h，發酵過程中間隔取樣，分別測定活菌數變化，結果如圖1 所示。由圖1可以看出，LH發酵較快，調整期非常短，迅速就進入了對數期，菌體數目呈幾何級增長，在整個對數期內，LH的活菌數對數值由最初的6.1增長至8.4，至發酵12 h后，開始進入穩定期。與LH不同，LR、LA和LM在發酵的前4 h內處于調整期，菌體數變化不大。有研究表明，調整期的長短與菌種、菌齡、培養條件等密切相關[18]。LM、LA在4～12 h處于菌體細胞數目高速增長的對數期，而后進入穩定期。從整個變化曲線來看，LR的發酵特性較其他3種表現得更有優良，在經過4 h的調整期后，菌體開始迅速增長，至發酵結束，菌體數最多，菌體數對數值增長至9.0，是初始活菌的1 000倍左右。

圖1 南瓜漿發酵過程中活菌數的變化Fig.1 Change of viable count during pumpkin pulp fermentation

2.2 各菌種對南瓜漿發酵過程中pH值的影響

發酵過程中pH值的變化如圖2所示。由圖2可以看出，這4種菌的pH值變化趨勢基本相同，隨著發酵時間的延長，pH逐漸下降，最后則趨于平緩，這一變化與發酵過程中活菌數的變化是相互對應的，也與丘裕等[19]的研究結果相類似，可把這一過程大致分為發酵初期、發酵旺盛期和發酵末期。在發酵初期，pH值變化緩慢，發酵速度相對較慢；發酵進入旺盛期，pH值下降很快，發酵達到高峰；至發酵末期，pH值變化又趨緩。在發酵開始的前4 h內，LA、LM、LR由于處于調整期，增長緩慢，所以生成乳酸的量較少，pH值變化不明顯。在發酵4 h之后，LA、LM、LR進入對數期，菌體細胞數呈幾何增加，微生物開始大量消耗南瓜漿中的營養物質，利用碳水化合物發酵生成大量乳酸，使得內部環境pH值快速下降。24 h后，菌體處于穩定期，可發酵糖含量已經大量減少，微生物增殖率和死亡率趨于平衡，活菌數基本保持不變，pH值的下降趨勢開始變得緩慢。LH由于處于調整期的時間短，迅速地就進入了對數期，所以，在發酵的前4 h，pH值下降速度要比其他3種益生菌快，至發酵12 h后，菌體數基本維持不變，pH值下降趨勢開始變得緩慢。

圖2 南瓜漿發酵過程中pH值的變化Fig.2 Change of pH value during pumpkin pulp fermentation

2.3 各菌種對南瓜漿發酵過程中酸度的影響

圖3 南瓜漿發酵過程中酸度的變化Fig.3 Change of acidity during pumpkin pulp fermentation

發酵過程中酸度的變化如圖3所示。從圖3可知，一方面，隨著發酵時間的延長，南瓜漿的酸度不斷增大，產酸量不斷增多，這一變化與pH值的不斷下降是相互對應的。另一方面，不同菌種的產酸量和產酸速率并不一相同，這說明各菌種的產酸能力存在差異性，而這本身與菌種理化特性不同是有關系的。發酵前12 h內，LH產酸速度快于其他菌株，產酸量增加了近10倍（由0.037 g/100 g增加至0.33 g/100 g），發酵至32 h后，產酸量趨于穩定，這與后期pH值的變化是一致的。在發酵剛開始的前4 h內，LR、LM、LA的產酸量基本保持不變，這與它們處于調整期相吻合。發酵至8 h后，LA、LR和LM產酸速度快于LH，其中又以LA的產酸速度最快，到發酵48 h時，產酸量達到由最初的0.032 g/100 g增加至1.24 g/100 g，是最初的40倍。LH在整個發酵過程中產酸趨勢與LM類似，發酵至32 h后，產酸量也趨于穩定，分別增長了25倍和19倍。而LR在整個發酵過程中產酸趨勢與LA相似，到發酵結束時，產酸量增長了32倍。從整個產酸量來看，LA和LR的產酸量要高于LM和LH。

2.4 各菌種對南瓜漿發酵過程中還原糖含量的影響

糖代謝對益生菌具有重要的生理學價值，益生菌最常用的糖類就是葡萄糖和果糖[20]，多糖和葡萄糖是南瓜的主要糖類物質，而在發酵過程中大部分活性多糖能被保留下來，葡萄糖則被微生物消耗利用[21]。因此，研究發酵過程中其還原糖的變化情況顯得很有必要。發酵過程中還原糖的變化結果如圖4所示。從圖4可以看到，在整個發酵過程中，還原糖含量隨著發酵的進行是逐漸降低的，這是由于益生菌代謝消耗南瓜漿中某些糖類物質，轉化成乳酸等產物所導致的結果。發酵前期，由于微生物快速增長繁殖，菌株消耗還原糖的速率加快，到了發酵后期，由于微生物數量保持不變，還原糖消耗量減少變慢。發酵前12 h內，LR還原糖的消耗量快于其他菌株，還原糖的含量下降了37.21%（由3.01 g/100 g下降至1.89 g/100 g）。發酵至24 h后，LA、LM、LR、LH還原糖含量下降趨勢開始變緩，這與菌體處于穩定期是有關系的。至發酵48 h，還原糖含量分別下降了56.48%、52.82%、48.17%、44.85%。

圖4 南瓜漿發酵過程中還原糖的變化Fig.4 Change of reducing sugar during pumpkin pulp fermentation

2.5 不同菌種發酵南瓜漿的感官評定

圖5 不同菌種發酵南瓜漿感官評定結果Fig.5 Sensory evaluation results of fermented pumpkin pulp by different strains

發酵南瓜漿的感官評分結果如圖5所示。從顏色和光澤方面看，LH和LR評分高于LA和LM。從組織狀態方面看，4種菌株發酵的南瓜漿數據相差較小，無顯著性差異。從氣味方面看，LR的評分是最高的，達4.8分，其次是LH和LA，分別是4.6分和3.9分，LM的評分是最低的，只有3.6分。原因是評定員認為它沒有了南瓜清香味，反而帶來一股異味，令人不悅。從滋味上看，最好的是LH，其次是LR，LA和LM的評分較低。所以，從總體上來看，LH、LR較LA和LM更適合發酵南瓜。

3 結論

發酵過程中，瑞士乳桿菌調整期并不明顯，接種后便迅速進入對數期，發酵速度要快于其他菌株。而鼠李糖乳桿菌在發酵過程中，其活菌數對數值最高，達9.0 lg（CFU/mL）。

發酵初期，pH值變化不是特別大；進入旺盛期，pH值下降明顯；發酵末期，pH值變化趨緩。另外，在產酸量和產酸速率上不同菌株存在差異性，發酵前期，瑞士乳桿菌產酸速率和產酸量較快。至發酵結束，嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌整體產酸量要多于瑞士乳桿菌和腸膜明串珠菌。在整個發酵過程中，菌株利用還原糖的能力存在個體差異，嗜酸乳桿菌和鼠李糖乳桿菌優于瑞士乳桿菌和腸膜明串珠菌。此外，活菌數、pH、還原糖含量和酸度之間的變化存在一定內在聯系。

四種發酵火南瓜漿的感官評價表明，瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌總體評分高于其他兩種，更適合發酵南瓜漿。所以從產酸、活菌數、感官等方面綜合考慮，最終確定發酵菌種為瑞士乳桿菌、鼠李糖乳桿菌。