MEBO對糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面纖維細(xì)胞生長的影響

李政 麻華膽 鄭愛甜 劉賢彬 王琳 曾娜 吳標(biāo)良

【摘要】?目的?體外觀察濕潤燒傷膏（moist exposed burn ointment，MEBO）對糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面纖維細(xì)胞生長的影響，探討MEBO促進(jìn)糖尿病慢性創(chuàng)面愈合的機(jī)制。方法?首先建立糖尿病創(chuàng)面大鼠模型，待第11天后分離、培養(yǎng)創(chuàng)面成纖維細(xì)胞，經(jīng)消化、傳代至第3代后，隨機(jī)將細(xì)胞分成對照組、MEBO組（1 g/L），采用CCK-8法檢測12、24、48、72、96 h細(xì)胞增殖情況，采用細(xì)胞劃痕來觀察MEBO對成纖維細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果?48 h起MEBO組各個時間點(diǎn)的OD值均高于對照組（P<0.05或0.001），細(xì)胞增殖率在72 h達(dá)到高峰;劃痕實(shí)驗(yàn)檢測顯示，MEBO組促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移能力比對照組強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論?MEBO可促進(jìn)糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面成纖維細(xì)胞增殖與遷移能力。

【關(guān)鍵詞】?MEBO;糖尿病;慢性創(chuàng)面;成纖維細(xì)胞;增殖

中圖分類號：R587.2?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2021.01.003

【Abstract】?Objective?To observe the effect of moist exposed burn ointment （MEBO） on the growth of fibroblasts in chronic wounds of diabetic rats， and to explore the mechanism of MEBO in promoting the healing of diabetic chronic wounds. Methods?Firstly， the diabetic wound model was established in rats， after 11 days， the wound fibroblasts were separated and cultured. After digestion and passage to the third generation， the cells were randomly divided into control group and MEBO group （1 g/L）. And then， the CCK-8 method was used to detect cell proliferation at 12 h， 24 h， 48 h， 72 h， 96 h， and cell scratches were used to observe the effect of MEBO on fibroblast migration. Results?The OD value of the MEBO group at each time point was higher than that of the control group from 48 h （P < 0.05 or 0.001）， and the cell proliferation rate reached the peak at 72 h; scratch test showed that the ability of MEBO group to promote fibroblast migration was stronger than that of the control group， and difference was statistically significant （P < 0.01）.Conclusion?MEBO can promote the proliferation and migration of fibroblasts from chronic wounds of diabetic rats.

【Key words】?MEBO; diabetes; chronic wound; fibroblasts; proliferation

隨著人口老齡化以及生活方式的改善，糖尿病的患病人數(shù)在逐年增加，而糖尿病慢性創(chuàng)面愈合困難已成為糖尿病患者致殘、致死的主要問題之一，創(chuàng)面愈合往往要經(jīng)歷凝血期、炎癥期、增殖期、重塑期四個階段，成纖維細(xì)胞生長在創(chuàng)面愈合中具有重要意義。濕潤燒傷膏（moist exposed burn ointment，MEBO）是一種在慢性創(chuàng)面領(lǐng)域應(yīng)用超過30年的傳統(tǒng)中醫(yī)藥，臨床應(yīng)用效果良好，但具體機(jī)制尚未闡明。本研究擬通過體外觀察MEBO對成纖維細(xì)胞生長的影響，探討MEBO促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的機(jī)制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動物

取自SPF級Wistar雄性大鼠的創(chuàng)面成纖維細(xì)胞，大鼠由長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2014-0011。該實(shí)驗(yàn)經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2?主要試劑

鏈脲佐菌素（STZ）：北京華越洋生物科技有限公司生產(chǎn);水合氯醛：成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn);胰蛋白酶、PBS液、二甲基亞砜（DMSO）：北京索萊寶公司生產(chǎn);ExCELL南美胎牛血清：烏拉圭ExCELL公司生產(chǎn);DMEM培養(yǎng)基：美國Gibco公司生產(chǎn);CCK8：日本同仁公司生產(chǎn);MEBO：汕頭市美寶制藥有限公司生產(chǎn)。

1.2?實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1?造模

大鼠先給予高糖高脂飲食1月余，禁食16 h后采用腹腔注射STZ 40 mg/kg，1周后大鼠若出現(xiàn)多飲、多尿、體重減輕等一系列糖尿病癥狀且空腹血糖≥16.7 mmol/L，為糖尿病大鼠模型建立成功[1]，需隔日復(fù)測血糖，至少2次以上達(dá)標(biāo)方為造模成功，糖尿病大鼠造模成功后，采用腹腔注射7%水合氯醛0.5 mL/100 g麻醉，大鼠麻醉成功后于背部備皮處理行約2.5 cm×2.5 cm大小的類圓形全層皮膚切除，即可完成糖尿病創(chuàng)面大鼠模型的建立，期間注意大鼠血糖情況，需每日定時皮下注射胰島素控制血糖。

1.2.2?成纖維細(xì)胞分離、培養(yǎng)及分組

取糖尿病創(chuàng)面大鼠模型的第11天肉芽組織（糖尿病潰瘍修復(fù)期），經(jīng)鹽水、PBS液清洗后進(jìn)行胰酶消化，將消化分離出組織的原代成纖維細(xì)胞放置到37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)，需隔天進(jìn)行換液，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞鋪滿整個瓶底的80%時再進(jìn)行傳代，第一次消化傳代后的細(xì)胞視為P1代，待細(xì)胞傳代至P3代時，胰酶消化細(xì)胞后平均分為2組（每組5個樣本）：常規(guī)培養(yǎng)組（對照組）、MEBO組，MEBO為膏狀藥物，需先將其溶解到二甲基亞砜（DMSO）配成原液，再按一定比例加入到培養(yǎng)基中，濃度配成1 g/L使用。

1.2.3?CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

取對數(shù)期生長的成纖維細(xì)胞，以2×104/孔的密度接種于96孔板中，將其放置37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)24 h后，分為對照組、MEBO組，每組設(shè)5個復(fù)孔。分別培養(yǎng)12、24、48、72、96 h，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，放回細(xì)胞孵箱孵育1.5 h，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長檢測各個孔吸光值（OD），并計算其各時間點(diǎn)增殖率：（A給藥/A對照-1）×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4?觀察MEBO對成纖維細(xì)胞遷移的影響

將成纖維細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，分為對照組、MEBO組，使用200 μL移液槍槍頭直接在中部劃直線，并做好標(biāo)記以確定相對位置。然后于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，分別于0、24 h時測量并記錄空白區(qū)，采用Image Pro Plus 6.0軟件按以下公式計算細(xì)胞遷移率：（0 h空白區(qū)-24 h空白區(qū)）/0 h空白區(qū)×100%。

1.3?統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示;兩組比較采用兩樣本t檢驗(yàn);各時點(diǎn)間比較采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2?結(jié)?果

2.1?MEBO對成纖維細(xì)胞增殖的影響

與對照組比較，MEBO組12 h、24 h的OD值雖高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而48 h、72 h、96 h均高于對照組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或0.001）;各時間點(diǎn)比較中，對照組、MEBO組的12 h與24 h間無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），MEBO組中的48 h與96 h間無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），MEBO組72 h與96 h間有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001），72 h的增殖率為最高值。見表1。

2.2?MEBO對成纖維細(xì)胞遷移的影響

細(xì)胞遷移24 h時，對照組與MEBO組細(xì)胞遷移率分別為（19.27%±1.95%）、（33.91%±3.68%），MEBO組的遷移率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.860，P<0.01）。見圖1。

3?討?論

2型糖尿病是由胰島素抵抗引起的高血糖代謝紊亂疾病，其患病率、復(fù)發(fā)率及死亡率在我國仍逐漸上升[2～3]，但隨著醫(yī)療條件及科技進(jìn)步，糖尿病慢性創(chuàng)面導(dǎo)致的截肢率有所下降[4]，糖尿病慢性創(chuàng)面為糖尿病的常見并發(fā)癥。因此，提高糖尿病慢性創(chuàng)面愈合率極為重要，但是目前我們對糖尿病慢性創(chuàng)面的病理和傷口的血管生成反應(yīng)的了解并不全面，除了加強(qiáng)血糖控制以外，促進(jìn)創(chuàng)面周圍血管生成、改善血管微循環(huán)、高壓氧療、手術(shù)介入等治療手段均有助于慢性創(chuàng)面的愈合[5]，因此，多學(xué)科治療糖尿病慢性創(chuàng)面是目前中國現(xiàn)有醫(yī)療條件最理想的治療模式。糖尿病足為糖尿病慢性創(chuàng)面最常見的一種疾病，有研究指出，在治療難治性糖尿病足過程中，多模式循環(huán)加壓局部傷口供氧家庭護(hù)理療法優(yōu)于一般標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理療法[6]。

纖維細(xì)胞為結(jié)締組織中的一種細(xì)胞，在創(chuàng)面愈合的過程中，特別是增殖期，纖維細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為活躍的成纖維細(xì)胞。創(chuàng)面修復(fù)是一個復(fù)雜而又精細(xì)的過程，大致可分為凝血期、炎癥期、增殖期和重塑期四個時期，其中包含了血小板、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等[7]，而成纖維細(xì)胞的增殖和遷移能促進(jìn)新生細(xì)胞外基質(zhì)以及肉芽組織來達(dá)到創(chuàng)面修復(fù)[8～9]。TEPLICKI等人[10]發(fā)現(xiàn)民間常用于治療皮膚輕微燒傷或者傷口的植物蘆薈，可通過刺激成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的增殖、遷移，從而達(dá)到加速創(chuàng)面愈合。

MEBO為目前燒傷或慢性創(chuàng)面治療的一種常用藥物，該藥物通過濕潤暴露、祛腐生肌、活血化瘀等傳統(tǒng)的中醫(yī)理念來使上皮組織、肌肉、神經(jīng)組織快速修復(fù)達(dá)到治療目的，縮短創(chuàng)面愈合時間。前期課題組已證明通過外用MEBO可使糖尿病大鼠創(chuàng)面中的成纖維細(xì)胞增殖，加速創(chuàng)面愈合。因此，本研究通過體外培養(yǎng)糖尿病大鼠成纖維細(xì)胞，在培養(yǎng)基中加入MEBO，觀察細(xì)胞生長情況。從CCK-8實(shí)驗(yàn)可知，在不同的時間點(diǎn)加入MEBO的成纖維細(xì)胞數(shù)量增多，其增殖率也升高，特別是在48 h以后差異有統(tǒng)計學(xué)意義，在72 h達(dá)到最高，之后降低。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，含有MEBO的成纖維細(xì)胞的遷移能力比對照組強(qiáng)。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果顯示，MEBO可促進(jìn)糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面成纖維細(xì)胞增殖，且使細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，對加速糖尿病大鼠慢性創(chuàng)面的愈合起到重要作用，但目前影響成纖維細(xì)胞增殖的機(jī)制未能完全闡明，需進(jìn)行下一步分子實(shí)驗(yàn)研究。

參?考?文?獻(xiàn)

[1]?劉亞洋. Apelin-13對糖尿病心肌缺血/再灌注損傷保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D]. 北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2019.

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[4]?XU Z R， RAN X W. Diabetic foot care in China：challenges and strategy[J]. Lancet Diabetes Endocrinol， 2016， 4（4）： 297-298.

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[6]?FRYKBERG R G， FRANKS P J， EDMONDS M， et al. A Multinational， Multicenter， Randomized， Double-Blinded， Placebo-Controlled Trial to Evaluate the Efficacy of Cyclical Topical Wound Oxygen （TWO2） Therapy in the Treatment of Chronic Diabetic Foot Ulcers： The TWO2 Study[J]. Diabetes care， 2020， 43（3）： 616-624.

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[8]?DRISKELL R R， LICHTENBERGER B M， HOSTE E， et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair[J]. Nature， 2013， 504（7479）： 277-281.

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[10]?TEPLICKI E， MA Q L， CASTILLO D E， et al. The Effects of Aloe vera on Wound Healing in Cell Proliferation， Migration， and Viability[J]. Wounds， 2018， 30（9）： 263-268.

（收稿日期：2020-08-20?修回日期：2020-10-26）

（編輯：潘明志）