高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)孕早期自然流產(chǎn)絨毛樣本染色體異常發(fā)生的Meta分析

辛淑文，楊少哲，胥 博，滕少俠，李榮香，付秀虹

（漯河市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心，河南漯河 462000）

自然流產(chǎn)（spontaneous abortion，SA）指非自然狀態(tài)下發(fā)生的流產(chǎn)，是婦產(chǎn)科的一種常見病，近年來的調(diào)查發(fā)現(xiàn)其發(fā)生率約占臨床妊娠的15%～20%。SA 的病因有以下幾個(gè)方面：遺傳因素、子宮解剖異常、免疫因素、內(nèi)分泌因素、感染因素等。其中染色體異常占50～60%，為主要因素[1]。近年來，研究胚胎染色體的技術(shù)日新月異。該類技術(shù)中，最先被應(yīng)用的是染色體核型分析技術(shù)，后來因絨毛樣本易被污染和培養(yǎng)周期長等缺點(diǎn)，而被熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridizatio，F(xiàn)ISH）補(bǔ)充和完善。而到目前為止，應(yīng)用廣泛的基因芯片技術(shù)、高通量測(cè)序（Next Generation Sequence，NGS）技術(shù)等。其中，NGS 技術(shù)因其通量高、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，在各個(gè)醫(yī)院被廣泛應(yīng)用。但是，由于醫(yī)院的研究人群分散、地域差異及各研究平臺(tái)不同等原因，造成孕早期SA 染色體異常率有差異。因此，本研究主要通過對(duì)2014年1月～2017年12月發(fā)表的共12篇文獻(xiàn)進(jìn)行薈萃分析，進(jìn)而對(duì)NGS 技術(shù)檢測(cè)孕早期自然流產(chǎn)絨毛樣本的染色體拷貝數(shù)變異情況進(jìn)行一次宏觀評(píng)價(jià)，為臨床提供更全面的指導(dǎo)建議。

1 材料與方法

1.1 資料來源

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究對(duì)象：所納入的樣本為早期流產(chǎn)絨毛樣本（孕周＜16 周）；②研究采用高通量測(cè)序方法對(duì)流產(chǎn)絨毛樣本染色體拷貝數(shù)變異情況進(jìn)行檢測(cè)；③自然流產(chǎn)診斷明確：停經(jīng)史，血液和尿液HCG 陽性，Torch 檢測(cè)為陰性，無有害物質(zhì)接觸史，超聲提示：無心管搏動(dòng)；④研究限中文或英文。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)：①孕周＞16 周；②采用其它檢測(cè)方法對(duì)樣本進(jìn)行染色體拷貝數(shù)變異情況檢測(cè)（如：基因芯片技術(shù)，染色體核型分析技術(shù)等）；③無法獲取原始數(shù)據(jù)文獻(xiàn)；④重復(fù)數(shù)據(jù)發(fā)表文獻(xiàn)數(shù)據(jù)小/不全；⑤數(shù)據(jù)來源不清晰等。

1.2 方法

1.2.1 檢索策略：根據(jù)關(guān)鍵詞檢索中國知網(wǎng)期刊數(shù)據(jù)庫（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)庫（WangFang Data）、維普中文科技期刊數(shù)據(jù)庫（VIP）、Pubmed 數(shù)據(jù)庫、EmBase 數(shù)據(jù)庫等中英文數(shù)據(jù)庫，檢索時(shí)限為2014年1月1日～2017年12月31日。

中文檢索詞包括：稽留流產(chǎn)、自然流產(chǎn)、胚胎停育、高通量測(cè)序技術(shù)、染色體拷貝數(shù)變異等。英文檢索詞包括：missed abortion，spontaneous miscarriage，pregnancy loss，high throughput genetic technology，chromosomal copy number variant 等，以及這些詞的自由組合檢索。

1.2.2 文獻(xiàn)篩選：按照上述檢索詞對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行查找，遵循所設(shè)定的納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)題目和摘要對(duì)研究進(jìn)行初篩。全文閱讀初篩通過的文章并提取原始數(shù)據(jù)。兩名研究人員獨(dú)立篩選然后交叉核對(duì)，如有歧義，通過共同討論或請(qǐng)求第三方協(xié)商。

提取內(nèi)容包含文獻(xiàn)發(fā)表基本信息、研究起止年份、研究地區(qū)、主要研究結(jié)果等。經(jīng)兩人核對(duì)一致后錄入。

文獻(xiàn)確定后根據(jù)卡斯?fàn)?渥太華量表（the Newcastle-ottawa scale，NOS）對(duì)文獻(xiàn)質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，NOS 滿分為9分，以≥5 分為高質(zhì)量研究。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Revman 4.3 軟件進(jìn)行Meta分析。通過Homogeneity test（Q 檢驗(yàn)）檢驗(yàn)進(jìn)行異質(zhì)性分析（檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05），同時(shí)結(jié)合I2定量判斷異質(zhì)性的大小。若P≥0.05 且I2≤50%，提示研究結(jié)果同質(zhì)，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析；若P≤0.05 且I2≥50%，提示研究結(jié)果異質(zhì)，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。通過 Egger’s 檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)可能存在的發(fā)表偏倚。Meta分析的檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果 首次檢索共檢出179篇相關(guān)文獻(xiàn)（中文115篇，英文64篇）。剔除重復(fù)文獻(xiàn)67篇，剩余112篇。這112篇文獻(xiàn)通過閱讀題目或摘要剔除90篇，剩余22篇。通過閱讀全文剔除10篇（孕周大于16 周或不予提供的有6篇，無法提取有效數(shù)據(jù)2篇，綜述1篇，2018年文獻(xiàn)1篇），最終得到12篇符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)[2-13]。納入文獻(xiàn)特征見表1。

表1 納入文獻(xiàn)基本特征

2.2 Meta分析結(jié)果所有12篇文獻(xiàn)共包含自然流產(chǎn)患者723例。各文獻(xiàn)納入研究對(duì)象差距較大，最少為15例[7]，最多為119例[11]。在對(duì)各文獻(xiàn)中陽性樣本數(shù)、染色體數(shù)目異常、微缺失/微重復(fù)的OR值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)合并，異質(zhì)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)上述三組數(shù)據(jù)中各獨(dú)立研究之間均存在異質(zhì)性（P＜0.05），因此采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行合并。

2.2.1 染色體總體異常率：見圖1。納入的12篇文獻(xiàn)中，總樣本例數(shù)723例，染色體異常共計(jì)477例。不同文獻(xiàn)報(bào)道的染色體異常率差異較大，最低52%，最高94%。隨機(jī)效應(yīng)模型Meta分析結(jié)果顯示，孕早期自然流產(chǎn)絨毛樣本染色體異常率（95%CI）為68%（0.58～0.76）。

圖1 胚胎流產(chǎn)絨毛樣本染色體陽性結(jié)果在總樣本例數(shù)的發(fā)生率

2.2.2 染色體數(shù)目異常率：見圖2。納入的12篇文獻(xiàn)中，染色體數(shù)目異常共計(jì)347例。不同文獻(xiàn)報(bào)道的染色體數(shù)目異常率差異較大，最低30%，最高67%。隨機(jī)效應(yīng)模型Me ta分析結(jié)果顯示，孕早期自然流產(chǎn)絨毛樣本染色體數(shù)目異常率（95%CI）為50%（0.43～0.57）。

圖2 流產(chǎn)絨毛樣本染色體數(shù)目異常在總樣本例數(shù)的發(fā)生率

2.2.3 染色體微缺失/微重復(fù)異常率：見圖3。納入的11篇文獻(xiàn)中（其中一篇無微缺失/微重復(fù)發(fā)生），染色體微缺失/微重復(fù)異常共計(jì)130例。不同文獻(xiàn)報(bào)道的染色體數(shù)目異常率差異較大，最低3%，最高41%。隨機(jī)效應(yīng)模型Meta分析結(jié)果顯示，孕早期自然流產(chǎn)絨毛樣本染色體微缺失/微重復(fù)異常率（95%CI）為16%（0.09～0.24）。

圖3 流產(chǎn)絨毛樣本染色體微缺失/微重復(fù)在總樣本例數(shù)的發(fā)生率

2.3 發(fā)表偏倚分析 用Egger's 檢驗(yàn)評(píng)價(jià)納入研究的偏倚風(fēng)險(xiǎn)，其結(jié)果見圖4，均P＞0.05。未發(fā)現(xiàn)所有的結(jié)局指標(biāo)存在發(fā)表偏倚，其結(jié)果受發(fā)表偏倚的影響可能性較小。

圖4 漏斗圖

3 討論

近年來，自然流產(chǎn)發(fā)生率約占臨床妊娠的15%～20%，給社會(huì)和家庭帶來沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。隨著遺傳學(xué)的發(fā)展，自然流產(chǎn)絨毛樣本的染色體拷貝數(shù)變異檢測(cè)應(yīng)用越來越廣泛。其中，CHEN 等[14]發(fā)現(xiàn)胚胎染色體數(shù)目異常在孕早期自然流產(chǎn)病人中所占比例高達(dá)50%，其中16 號(hào)染色體數(shù)目異常竟占總異常率的30.6%。SAHOO 等人[15]采用基因芯片技術(shù)分析了美國8 118個(gè)胚胎組織（其中83%為發(fā)生自然流產(chǎn)的胚胎），53.7%的子代表現(xiàn)為染色體異常。染色體異常在早期流產(chǎn)絨毛樣本檢測(cè)占據(jù)這么重要的地位，無疑給自然流產(chǎn)的診治提供了新思路。

本研究納入12篇文獻(xiàn)，723例自然流產(chǎn)樣本，發(fā)現(xiàn)染色體異常率為68%，略高于辛淑文等[16]研究的56.4%。兩研究的數(shù)目異常率相同，均為50%。本研究的微缺失/微重復(fù)異常率為16%，同樣略高于辛淑文等[16]研究的13.28%。可能與辛淑文等[16]的研究中將小于4Mb 異常稱為微缺失/微重復(fù)，而微缺失/微重復(fù)片段大于4Mb 的染色體異常定義為染色體結(jié)構(gòu)異常有關(guān)。染色體微缺失/微重復(fù)同樣是患兒多發(fā)畸形的主要原因[17]。本Meta分析納入的研究覆蓋地域較廣，各研究的樣本量較小，高通量測(cè)序平臺(tái)多樣等原因也可能是導(dǎo)致結(jié)果和單一文獻(xiàn)結(jié)果有差別的原因。

2005 年，454 Life Sciences 公司最先推 出了基于焦磷酸測(cè)序法的超高通量基因組測(cè)序系統(tǒng)，奠定了第二代測(cè)序技術(shù)的基礎(chǔ)。NGS 技術(shù)較傳統(tǒng)Sanger 測(cè)序法有三大優(yōu)勢(shì)[18]：第一，可在數(shù)百萬個(gè)點(diǎn)上同時(shí)閱讀測(cè)序，因此也稱之為大規(guī)模平行測(cè)序（massively parallel signature sequencing,MPSS）；第二，具有完美的定量功能；第三，成本低廉。基于NGS 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，遂被逐漸應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。近年來，逐漸被各大醫(yī)院用于對(duì)遺傳性疾病的診斷工作[17,19]。

所納入文獻(xiàn)染色體異常率存在差異的原因，主要有以下幾個(gè)方面：①人群地域特征；本研究所納入人群大多集中在北方地區(qū)。可能受南北方地域差異、人們意識(shí)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平的影響，導(dǎo)致所納入人群有差異。因文獻(xiàn)數(shù)量有限，未對(duì)南方和北方進(jìn)行亞組分析。希望通過本研究可為今后進(jìn)一步比較地域差異打下基石。②各研究的測(cè)序儀器不同，本研究所使用的測(cè)序儀器主要有Hiseq2000，Nextseq CN500 等，可能在測(cè)序深度和結(jié)果取舍方面存在差異；③各研究所納入的樣本例數(shù)存在差異；④取材方面：絨毛樣本取材特殊性，不同部位取材可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本系統(tǒng)評(píng)價(jià)采用無對(duì)照研究的Meta分析方法[20]，對(duì)NGS 技術(shù)檢測(cè)早期流產(chǎn)絨毛染色體異常率進(jìn)行合并分析，了解染色體整體異常率，數(shù)目異常率，微缺失/微重復(fù)異常率的發(fā)生情況，為自然流產(chǎn)尋找遺傳學(xué)因素。本研究發(fā)現(xiàn)孕早期自然流產(chǎn)絨毛樣本染色體異常率68%，染色體數(shù)目異常率為50%，染色體微缺失/微重復(fù)異常率為16%。合并結(jié)果表明高通量測(cè)序技術(shù)可以作為檢測(cè)孕早期絨毛樣本染色體是否異常的重要手段，染色體異常是孕早期自然流產(chǎn)的重要原因。