DA3200-ABI7500全自動(dòng)核酸提取平臺(tái)高敏HCV RNA定量檢測(cè)性能驗(yàn)證

馮飛雪，王大望，肇玉博，王 凱，周嘉迪，王戰(zhàn)爭(zhēng)，王 麗，馬艷俠，史小武

（1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，陜西咸陽(yáng) 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西咸陽(yáng)712000；3.咸陽(yáng)市中心血站檢驗(yàn)科，陜西咸陽(yáng) 712000）

慢性丙型肝炎病毒( hepatitis C virus，HCV) 感染是引起全球慢性肝病的主要原因之一，可發(fā)展為肝硬化和肝癌[1-2]，構(gòu)成了世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。既往研究表明HCV RNA 在一定程度上反映了HCV 的復(fù)制活性，定量檢測(cè)HCV RNA 對(duì)HCV感染診斷、疾病進(jìn)展以及抗病毒治療方案制定等起著重要作用[3]。近年來(lái)，慢性HCV 防治指南中推薦采用最低檢出限≤30 IU/ml 的實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative PCR）檢測(cè)HCV RNA，而最低檢出限為500～1 000 IU/ml 的傳統(tǒng)手工磁珠法和柱提法檢測(cè)已無(wú)法滿足臨床需求[4]。目前出現(xiàn)的全自動(dòng)核酸提取及高敏檢測(cè)系統(tǒng)，因其自動(dòng)化程度高和高敏檢測(cè)受到各大醫(yī)院的喜愛(ài)。本研究擬對(duì)DA3200-ABI7500全自動(dòng)核酸提取平臺(tái)及高敏HCV RNA定量檢測(cè)進(jìn)行性能驗(yàn)證，包括：提取效率、精密度（批內(nèi)，批間）、正確度、線性范圍、分析靈敏度、特異度和抗污染能力，以確保采用的相關(guān)試劑盒分析性能滿足臨床要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 儀器：實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司，ABI7500），DA3200全自動(dòng)核酸提取平臺(tái)（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），NanoDrop 分光光度計(jì)。試劑：丙型肝炎病毒核酸提取試劑盒和PCR 定量測(cè)定試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），丙型肝炎病毒核糖核酸（HCV RNA）血清液體性能評(píng)價(jià)參考品（廣州邦德盛生物科技有限公司），詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 核酸參考盤樣品信息

1.2 方法

1.2.1 高敏HCV RNA 提取及檢測(cè)：提取方法為磁珠法，檢測(cè)方法為實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。用DA3200全自動(dòng)核酸提取儀提取血清中的HCV RNA，并進(jìn)行PCR 反應(yīng)體系的配置，反應(yīng)體系為60 μl[2 μl 引物+3 μl 酶混合液+15 μl 反應(yīng)混合液+40 μl 模板，其中模板包括待測(cè)樣本、陽(yáng)性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和4個(gè)定量參考品（濃度為:1.0 E+06 IU/ml，1.0 E+05 IU/ml，1.0 E+04 IU/ml，1.0 E+03 IU/ml）]；將配置好的PCR 體系放入到ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀中進(jìn)行HCV RNA定量檢測(cè)；擴(kuò)增參數(shù)50℃ 900s；95℃ 900s；94℃ 15s，55℃45s，45個(gè)循環(huán)。結(jié)果的處理與計(jì)算：質(zhì)控品滿足質(zhì)控要求方可進(jìn)行后續(xù)結(jié)果判定，定性結(jié)果根據(jù)儀器的FAM 通道和VIC 通道及Ct值進(jìn)行判定，定量結(jié)果根據(jù)4個(gè)定量參考品得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行確定。所有操作嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作程序以及試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 性能評(píng)價(jià)：

1.2.2.1 核酸提取純度驗(yàn)證：使用DA3200全自動(dòng)核酸提取儀提取血清中的HCV RNA，用NanoDrop分光光度計(jì)對(duì)提取后的HCV RNA 進(jìn)行純度鑒定，吸光度A260nm/A280nm應(yīng)在1.8～2.2之間。

1.2.2.2 精密度驗(yàn)證：參考EP15-A3 文件[5]。①批內(nèi)精密度：核酸參考盤R1（1.2E+04 IU/ml）做為高值樣本，R2（0.5E+02 IU/ml）作為低值樣本，兩個(gè)濃度樣本在同一批次內(nèi)重復(fù)測(cè)定20 次。②批間精密度：同上選擇高（R1）、低（R2）兩種濃度水平作為待測(cè)樣本，每天檢測(cè)一個(gè)批次，重復(fù)測(cè)定4 次，連續(xù)測(cè)定5 天。計(jì)算均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，精密度CV值≤5%為合格。

1.2.2.3 正確度驗(yàn)證：參考EP15-A3 文件[5]。以2019年第二次衛(wèi)生部室間質(zhì)評(píng)的5個(gè)HCV 樣本和參考盤中的L1～L5 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行正確度驗(yàn)證，樣本測(cè)定結(jié)果的均值對(duì)數(shù)值與參考值對(duì)數(shù)值之間的絕對(duì)偏倚≤±0.4 lg IU/ml 為合格。

1.2.2.4 線性范圍驗(yàn)證：參考EP6-A 文件[6]。使用核酸類參考盤中L1～L5 樣本，并將L5 稀釋10 倍編號(hào)為L(zhǎng)6（濃度為13 IU/ml，lg值為1.11）；6個(gè)濃度標(biāo)本重復(fù)測(cè)定2 次，對(duì)實(shí)測(cè)值的均值與理論值進(jìn)行線性回歸分析并做線性回歸圖，判定系數(shù)r2≥0.98 為合格。

1.2.2.5 分析靈敏度驗(yàn)證：參考EP6-A 文件[6]。將核酸類參考盤中的R2 稀釋到試劑盒說(shuō)明書標(biāo)示靈敏度濃度（20 IU/ml），重復(fù)檢測(cè)20 次，陽(yáng)性檢出率≥95%為合格。

1.2.2.6 特異度驗(yàn)證：選取核酸參考盤中HCV RNA 陰性參考品N1～N8，所有標(biāo)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果符合預(yù)期為合格。

1.2.2.7 抗干擾能力驗(yàn)證：參考EP7-A2 文件[7]。以核酸參考盤中的G1，G2，G3，G4作為干擾組樣本，測(cè)定結(jié)果的均值對(duì)數(shù)值與正常組對(duì)數(shù)值之間的絕對(duì)偏倚≤±0.4 lg IU/ml 為合格。

1.2.2.8 抗污染能力驗(yàn)證：在DA3200的樣本架上，將L1 高濃度樣本（1.3 E+06 IU/ml）和N1～N8 陰性樣本以間隔的方式放置，驗(yàn)證儀器攜帶污染的情況和抗污染能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，HCV RNA 濃度值轉(zhuǎn)換為濃度對(duì)數(shù)值lgIU/ml后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料計(jì)算均數(shù)（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（s）、變異系數(shù)（CV），各組指標(biāo)相關(guān)性采用雙變量相關(guān)分析，函數(shù)關(guān)系采用線性回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 核酸提取純度結(jié)果A260nm/A280nm的值為2.02，表明DA3200全自動(dòng)核酸提取儀提取效能符合要求。

2.2 精密度驗(yàn)證結(jié)果 見(jiàn)表2。批內(nèi)精密度實(shí)驗(yàn)和批間精密度實(shí)驗(yàn)CV值均≤5%，表明批間和批內(nèi)重復(fù)性好。

表2 批內(nèi)和批間精密度檢測(cè)結(jié)果

2.3 正確度驗(yàn)證結(jié)果 見(jiàn)表3。參考物質(zhì)和室間質(zhì)控樣本共10個(gè)標(biāo)本均檢出，檢測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)值與靶值對(duì)數(shù)值之間的絕對(duì)偏倚均≤±0.4lg值，表明試劑正確度較好。

表3 正確度檢測(cè)結(jié)果

2.4 線性范圍驗(yàn)證結(jié)果 經(jīng)雙變量相關(guān)分析和線性回歸分析，6個(gè)不同HCV RNA 濃度實(shí)測(cè)值與理論值呈高度正相關(guān)性（r=0.999，P=0.000），線性回歸方程：Y=0.984X - 0.186，r2=0.998 ≥0.98，P=0.000，符合線性相關(guān)系數(shù)要求，表明在此濃度范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系（見(jiàn)圖1）。

圖1 線性范圍實(shí)驗(yàn)圖

2.5 分析靈敏度驗(yàn)證結(jié)果 20 IU/ml 濃度樣本的陽(yáng)性檢出率為100%，但CV值為16.17%，雖檢出率好，但數(shù)據(jù)間變異程度較大。

2.6 特異度驗(yàn)證結(jié)果所有陰性標(biāo)本均未檢出，達(dá)到試劑特異度要求。

2.7 抗干擾能力驗(yàn)證結(jié)果 干擾組樣本測(cè)定結(jié)果的均值對(duì)數(shù)值與靶值對(duì)數(shù)值之間的絕對(duì)偏倚≤±0.4 lg IU/ml，試劑抗干擾驗(yàn)證通過(guò)。

2.8 抗污染能力驗(yàn)證結(jié)果 高濃度陽(yáng)性樣本均檢出，陰性樣本均未檢出，表明系統(tǒng)具有很好的抗污染能力。

3 討論

HCV 是一種單正鏈RNA 病毒，當(dāng)其侵入肝細(xì)胞后，會(huì)造成肝細(xì)胞的損傷，甚至是壞死。隨著索非布韋（sofosbuvir，SOF）藥物的上市，丙肝成為一種可以治愈的疾病。但是，很大一部分丙肝患者在初期不表現(xiàn)任何臨床癥狀，甚至有些慢性患者可以在20年內(nèi)沒(méi)有任何明顯的癥狀，導(dǎo)致了患者以及醫(yī)務(wù)人員對(duì)于丙肝感染的忽視，當(dāng)出現(xiàn)臨床癥狀時(shí)，疾病往往到了惡性期。故對(duì)丙肝患者的早篩查、早發(fā)現(xiàn)對(duì)于防止病情的惡化以及降低死亡率具有重要意義，而HCV RNA 的檢出是丙肝確診的標(biāo)準(zhǔn)，換句話說(shuō)，就是怎么在這些慢性患者中檢出低載量的HCV RNA。其次，治療后患者血液中HCV RNA的含量對(duì)于治療方案的制定以及治療終點(diǎn)的判斷有著重要的作用[8]，有權(quán)威機(jī)構(gòu)指出HCV 的治療終點(diǎn)是在治療后24 周內(nèi)（或12 周內(nèi)）未檢測(cè)到HCV RNA（方法檢出限＜15 IU/ml）[9]。此外，HCV RNA 濃度還對(duì)耐藥監(jiān)測(cè)有著一定的影響[10]。如何去檢測(cè)出患者血液中低載量的HCV RNA，如何保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性已成為當(dāng)前檢測(cè)難題之一。

本研究通過(guò)使用DA3200全自動(dòng)核酸提取儀對(duì)HCV 患者血清的提取，減少了人工操作的污染以及操作過(guò)程中的不確定性；使用ABI7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 對(duì)提取后的核酸進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)，其聚集了PCR 的高敏感度、高特異度，光譜系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，以及檢測(cè)的實(shí)時(shí)性[11]，提高了檢測(cè)的靈敏度，實(shí)現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)過(guò)程的全自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化，很好的保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究中的DA3200-ABI7500全自動(dòng)核酸提取、擴(kuò)增、檢測(cè)系統(tǒng)，因檢出限低，其他性能良好，可以很好地解決上述所說(shuō)的難題，實(shí)現(xiàn)低量檢出HCV RNA，為確診、治療提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，在一定程度上促進(jìn)了個(gè)體化、精準(zhǔn)化治療的進(jìn)程。

近年來(lái)，核酸檢測(cè)是臨床分子實(shí)驗(yàn)室的重要檢測(cè)項(xiàng)目之一，檢測(cè)結(jié)果對(duì)病情的診斷及治療有著重要意義。之前HCV RNA 的提取方式為人工柱抽提法和磁珠法，存在著操作復(fù)雜、靈敏度低等問(wèn)題。最近國(guó)內(nèi)外廠家相繼推出全自動(dòng)核酸提取儀，最大限度減少人為操作的污染，增加結(jié)果的準(zhǔn)確性。未來(lái)HCV RNA的檢測(cè)將向著提取、擴(kuò)增、檢測(cè)一體化，全自動(dòng)化的方向前進(jìn)。此外，POCT 儀器的出現(xiàn)讓HCV RNA 檢測(cè)更加快速、便捷[12]，但其結(jié)果的準(zhǔn)確性及靈敏度還有待驗(yàn)證。微流體技術(shù)[13]（流體處理的小型化）和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[14]的出現(xiàn)，加速了PCR 的發(fā)展，雖然其具有速度快、成本低、反應(yīng)模式微小等特點(diǎn)，但因技術(shù)限制，兩者還不能廣泛的應(yīng)用于臨床。隨著技術(shù)的發(fā)展，PCR 將會(huì)被更好地應(yīng)用于疾病的篩查、診斷等方面。