碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌的實驗室研究及與臨床轉歸相關危險因素分析

賈艷增，馬玉蘭，陳 瑩，時東彥

（1.河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院檢驗科，石家莊 050000；2.石家莊第四醫(yī)院檢驗科 ，石家莊 050017）

肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumonia,KPN)是臨床常見的條件致病菌，在新生兒、老年人和免疫功能低下的患者引起廣泛的疾病，包括肺炎、尿路感染、血流感染等。然而，高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulentKlebsiella Pneumonia,HvKP）是一種日益被認識的病原菌，比普通的肺炎克雷伯菌（classicKlebsiella Pneumonia,cKP）更具有毒性，可導致健康的年輕人致病，包括肝膿腫、肺炎、腦炎等嚴重的社區(qū)獲得性感染，具有侵襲性[1]。由于抗生素的不規(guī)范使用以及毒力質粒、耐藥質粒在細菌之間快速傳播，目前出現(xiàn)了高毒力碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌（hypervirulent and carbapenem-tesistantKlebsiella pneumonia,CR-HvKP）[2]，CR-HvKP具有HvKP 的特性，極強的侵襲力，極易播散，造成血流感染、胸腔感染、腹腔及眼內炎、中樞神經系統(tǒng)的感染及其它器官的感染，導致嚴重的感染[3-5]。CR-HvKP 檢出率不斷增加，不但給治療帶來困難，同時顯著增加了臨床治療難度,成為臨床中導致患者死亡的重要因素[1，6]。不同地區(qū)CR-HvKP感染情況和致死情況不同,本研究針對河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院CR-HvKP 的實驗室檢測及臨床轉歸相關危險因素分析。

1 材料及方法

1.1 研究對象 回顧性分析河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院2016年12月～2017年12月高毒力碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌20例，其中來自痰/肺泡灌洗液標本16例，腹腔引流液 1例，血培養(yǎng)3例。

1.2 儀器與試劑 全自動微生物鑒定儀：法國生物梅里埃公司Vitek2 Compact，聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀（美國Bio-Rad 公司），凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司），電泳儀（上海康華公司），細菌DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司），2×Taq Master Mix（北京康為科技有限公司），50×TAE 緩沖液（上海生工有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 收集臨床資料：選取2016年12月～2017年12月CR-HvKP感染20例患者為研究對象，記錄患者年齡、住院天數(shù)、臨床抗生素治療方案及治療效果、感染嚴重程度（如感染性休克）評估等因素。

1.3.2 菌株鑒定及藥敏試驗：采用法國生物梅里埃公司全自動微生物鑒定儀Vitek2 Compact 進行菌株鑒定及藥敏試驗,采用E-test 法進行替加環(huán)素的藥敏試驗，藥敏結果判定標準參照CLSI2016年進行判讀藥敏結果；質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC700603，大腸埃希菌ATCC25922。

1.3.3 高黏液表型檢測：采用拉絲試驗方法，用接種環(huán)挑取血瓊脂平板上新鮮菌落進行牽拉，黏液絲形成且長度≥5mm則判斷為高黏液表型陽性，黏液絲形成且長度＜5mm 判斷為陰性。

1.3.4 高毒力肺炎克雷伯菌菌株：參照文獻[7-8]資料，采用PCR 檢測毒力基因(rmpA，rmpA2)、血清型（K1，K2）、碳青霉烯酶基因（KPC-2，NDM-1，OXA，VIM 和IMP）。

1.3.5 碳青霉烯酶表型檢測：用接種環(huán)刮取受試菌株并加入2ml TSB 中，再將10μg 美羅培南紙片浸入菌懸液中，然后用無菌棉簽蘸取大腸埃希菌ATCC25922 菌懸液（0.5 麥氏濁度單位）均勻涂抹于M-H 瓊脂平板上，最后將藥敏紙片從菌懸液中取出，貼在該M-H 瓊脂平板上。結果判讀：抑菌圈直徑6～15mm 或在16～18mm 抑菌圈內存在菌落，則碳青霉烯酶陽性。

1.3.6 血清殺傷試驗：將肺炎克雷伯菌懸液中放入人血清抗體，接種于Mueller-Hinton 瓊脂板，接種后1h 菌量在10%～100%之間，3h 后＜10%為高敏感；1h 內過度生長＞100%，2h 后或3h 后＜100%為中敏感；1h，2h 及3h 后均過度生長＞100%為抵抗組。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用 SPSS21.0 統(tǒng)計軟件對研究數(shù)據進行統(tǒng)計學分析,計量資料用均數(shù)±標準差（±s）（年齡、住院天數(shù)）表示，采用t檢驗；計數(shù)資料用頻數(shù)表示，采用卡方（χ2）檢驗或Fisher 確切概率法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 20 例CR-HvKP感染患者的實驗室檢測結果 見表1。20例CR-HvKP感染患者中男性17例，女性3例，標本來源主要為痰/肺泡灌洗液16例（80%）。毒力基因rmpA2 均為陽性，拉絲試驗陽性17例（85%），血清殺傷試驗均為抵抗組，K2型血清型16例（80%），碳青霉烯酶基因KPC-2型18例（90%），碳青霉烯酶表型mCIM 均為陽性。

表1 20例CR-HvKP感染患者的實驗室檢測結果

2.2 20 例CR-HvKP感染患者臨床轉歸相關危險因素分析 見表1。20例CR-HvKP感染患者中治療好轉9例，治療無效11例，治療有效率為45%，治療好轉組與治療無效組年齡比較,差異無統(tǒng)計學意義（t=1.446，P＞0.05)；兩組在氣管插管輔助呼吸、并發(fā)癥危及生命的感染性休克比較,差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=7.593，5.690，均P＜0.05)。

表2 20例CR-HvKP感染患者臨床轉歸相關危險因素的分析

3 討論

目前國內外臨床實驗室判定HvKP 主要根據拉絲試驗陽性[9-10]，但本研究顯示并不是所有的HvKP拉絲試驗均為陽性,因此本研究根據文獻[7-8]通過毒力基因rmpA/rmpA2 陽性并通過血清殺傷試驗抵抗組確定為HvKP。

過去觀點認為HvKP 很少對抗生素產生耐藥性，除了天然耐藥氨芐西林,大多數(shù)菌株對常用藥物均敏感，但近年來研究發(fā)現(xiàn)HvKP 存在多種結合和整合元素，使毒力基因/耐藥基因在細菌之間通過質粒傳播[11-14]。目前，主要有兩種途徑形成CR-HvKP:一種是碳青霉烯耐藥高毒力肺炎克雷伯菌（carbapenem-ResistantKlebsiella pneumoniae，CRKP） 通過質粒獲得毒力基因而形成CR-HvKP；另一種為HvKP 通過質粒獲得碳青霉烯酶基因形成的[13]，且可以在細菌之間快速傳播[14-15]。CRHvKP 具有高毒性、耐多藥和傳播性的特點被稱為真正超級細菌，給臨床治療和醫(yī)院感染控制帶來巨大的挑戰(zhàn)，因此需要迫切的對這種新型菌進行實驗室檢測及臨床轉歸相關危險因素分析是十分必要的。

本研究結果顯示，碳青霉烯酶基因以KPC-2型為主，與DONG 等[16]報道一致。血清型以K2 為主，與SIU 等[17]報道一致，而ZHANG 等[18]在2016年報道過5例K1 血清型的CR-HvKP，而杜芳玲等[19]在2019年報道過2例K1型CR-HvKP 與2例K2型的CR-HvKP，提示目前K1、K2 血清型均出現(xiàn)了CR-HvKP，而在我院以K2 血清型為主，這種K2型CR-HvKP 存在的具體機制有待進一步深入研究。mCIM 試驗用于檢測碳青霉烯酶表型確認的方法，具有非常高的敏感度和特異度[20]。研究結果顯示，20例CR-HvKP 菌株中均為陽性，其中2株未檢測出攜帶碳青霉烯酶基因，與文獻[21]報道一致，具體原因尚不清楚。

研究結果顯示，20例CR-HvKP感染患者中，治療好轉為45%，目前臨床對CR-HvKP 抗感染治療選擇的藥物非常有限，往往選擇聯(lián)合治療。美羅培南聯(lián)合替加環(huán)素病例最多，治愈率為為42.9%，低于WU 等[22-24]報道替加環(huán)素治療碳青霉烯耐藥的腸桿菌治愈率為51.6%，提示美羅培南聯(lián)合替加環(huán)素臨床治療效果沒有預期理想，可能和患者的基礎疾病及藥物的聯(lián)合治療藥效有關，其機制有待進一步研究。美羅培南聯(lián)合多黏菌素由于例數(shù)較少，臨床意義不足。盡管體外藥敏試驗對替加環(huán)素敏感，但長期使用這種抗生素(單獨使用或與其他幾種抗生素聯(lián)合使用)，甚至多粘菌素B，都不能從血液中根除這種微生物，導致致命的結果[21]。目前有一些新的藥物逐漸上市（頭孢他定-阿維巴坦等），希望對此類細菌有更好的體內殺菌效果。

進一步分析臨床資料顯示20例CR-HvKP感染患者住院天數(shù)平均＞30天，住院時間較長。本研究還進行了治療好轉與治療無效患者使用氣管插管呼吸機輔助呼吸、感染性休克比較差異有統(tǒng)計學意義，提示氣管插管呼吸機輔助呼吸以及引起危及生命的感染性休克并發(fā)癥影響治療效果，因此該醫(yī)院20例CR-HvKP 的臨床治愈率極差，即使治愈，治愈的用藥天數(shù)、感染嚴重程度遠高于普通肺炎克雷伯菌感染。因此對于此類患者的預后評估非常復雜，要綜合基礎疾病，輔助治療，藥物選擇等綜合判斷。

CR-HvKP 具有高侵襲性、致病力強以及高耐藥限制了臨床有效藥物治療，使臨床面對治療CRHvKP感染相當?shù)睦щy，造成CR-HvKP感染的高死亡率且細菌的傳播性強，因此應引起高度重視。