一個單純型甲基丙二酸血癥家系的MUT基因突變分析

陳璐 金一幫 童郁 潘麗琴 李陽陽 施建有 戴顯寧 蔡曉曉 許鍇

甲基丙二酸血癥（methylmalonic aciduria，MMA）又稱甲基丙二酸尿癥，為常染色體隱性單基因遺傳病，也是一種常見的有機(jī)酸血癥，發(fā)病率一般為1/48 000～1/250 000[1]。該病主要是由于甲基丙二酰輔酶A變位酶（methylmalonyl-CoA mutase，MCM）自身缺陷或其輔酶腺苷鈷胺素（Ado-Cbl）代謝缺陷所致[2]，使甲基丙二酰輔酶A向琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)換過程受阻；該酶的缺乏導(dǎo)致血液中甲基丙二酸及其相關(guān)有機(jī)酸增高，甲基丙二酸、甲基丙二酰肉堿、丙酸、甲基枸櫞酸等中間代謝產(chǎn)物體內(nèi)異常蓄積，進(jìn)而引起肝、腎、腦等多臟器損傷，致死率、致殘率高[3-4]。MMA臨床表型及基因型復(fù)雜，至今已發(fā)現(xiàn)7種致病變異基因，分別是MMACHC、MUT、MMAA、MMAB、HCFC1、SUCLG1、SUCLA2 型，在我國以 MMACHC基因變異引起的MMA合并同型半胱氨酸血癥最為多見，MUT基因變異引起的單純型MMA次之[5]。筆者對1例單純型MMA患兒進(jìn)行早期干預(yù)診療，同時對該家系進(jìn)行基因檢測，以預(yù)防缺陷患兒再出生，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 MMA先證者為2018年12月溫州市人民醫(yī)院新生兒科收治的1例足月產(chǎn)男嬰，氣促5 h，呻吟不安，擬“呼吸困難，肌張力低下”收住入院。其父母此前生育過1例疑似MMA病男嬰，出生10余天夭折。患兒入院后檢驗(yàn)指標(biāo)顯示頑固性酸中毒PCO226 mmHg，HCO3-5.9 mmol/L；低血糖 0.7 mmol/L，高血氨 126 μmol/L，高乳酸16 mmol/L。顱腦MRI檢查顯示雙側(cè)枕部及天幕硬膜下血腫。對夫婦進(jìn)行遺傳咨詢，雙方非近親婚配，否認(rèn)有家族性遺傳病史。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 遺傳代謝疾病檢測 采集患兒指尖靜脈血，滴于專用濾紙片上陰干送檢。采用串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國ABI公司API4000型）對共22種氨基酸、55種酰基肉堿進(jìn)行檢測。采集患兒尿?yàn)V紙片標(biāo)本，安裝新生兒尿袋留取新鮮尿液5ml，將尿液倒入無菌治療碗中，將尿滲透濾紙浸潤自然干燥后送檢。采用氣相色譜質(zhì)譜儀（美國ABI公司API3200型）對尿液中的132種有機(jī)酸、氨基酸等代謝化合物進(jìn)行檢測。

1.2.2 DNA提取和全外顯子測序 采集患兒靜脈血2 ml于EDTA抗凝管中，用QIAampDNA Blood MiniKi（t德國Qiagen公司）試劑盒提取基因組DNA，Qubit 2.0（美國Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行DNA定量。取0.5 μg患兒樣本DNA用超聲儀（BioruptorNGS）隨機(jī)打斷成200 bp片段，用Truseq DNA Sample Preparation試劑盒處理兩端連接測序接頭構(gòu)建文庫，使用Roche Nimblegen SeqCap EZ v5.1試劑盒捕獲全外顯子區(qū)域，采用Illumina XTEN平臺進(jìn)行高通量測序分析查找可疑病因。

1.2.3 Sanger測序驗(yàn)證 針對致病MUT基因的突變位點(diǎn)所在外顯子區(qū)域設(shè)計PCR上下游引物，以患兒及其父母的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，用Sanger測序法進(jìn)行驗(yàn)證。PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳后由ABI3730完成一代測序；查看Sanger測序峰圖（Chrmos軟件），比對Sanger測序結(jié)果（SeqMan軟件）展開驗(yàn)證。

1.2.4 突變致病性預(yù)測分析 對基因突變的致病性進(jìn)行預(yù)測，將人類與其他種屬的MCM氨基酸序列進(jìn)行物種保守性比對分析。針對突變位點(diǎn)分析MUT基因突變前后由氨基酸變化引起的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變，初步闡明突變位點(diǎn)致病的可能機(jī)制。生物信息分析預(yù)測選用Polyphen-2、SIFT、Clustal X 和 Swiss-PdbViewer軟件。

2 結(jié)果

2.1 遺傳代謝疾病檢測 患兒血丙酰基肉堿13.61 mol/L（參考值 0.35～4.20 mol/L），丙酰肉堿/乙酰肉堿 0.85 μM（參考值 0.03～0.20 μM）；尿液檢測甲基丙二酸為116.81 μM（參考值 0.2～3.6 μM），甲基枸緣酸為 3.65 μM（參考值0～1 μM），均顯著高于正常參考值。

2.2 基因測序結(jié)果 本例患兒MUT基因?yàn)閺?fù)合雜合突變：（1）c.1280 G＞A（p.Gly427Asp）（編碼區(qū)第 1280 號核苷酸由鳥嘌呤變異為腺嘌呤），導(dǎo)致氨基酸改變p.Gly427Asp（錯義突變）。患兒母親該位點(diǎn)為雜合變異，父親無變異。（2）c.1677-1G＞A（p.?）（外顯子的最后一個堿基位于編碼區(qū)1677位，該外顯子相鄰前方的內(nèi)含子的第一個堿基由鳥嘌呤變異為腺嘌呤）為剪切突變，不屬于多態(tài)性位點(diǎn)。患兒父親該位點(diǎn)存在變異，母親無變異。患兒及其父母MUT基因測序見圖1。

2.3 基因突變的生物信息學(xué)分析 查詢dbSNP、Hapmap、千人基因組計劃等數(shù)據(jù)庫，未發(fā)現(xiàn)MUT基因c.1280G＞A具有多態(tài)性的可能。Polyphen-2軟件對這個變異的預(yù)測分?jǐn)?shù)為1，提示突變?yōu)橛泻ν蛔儯▓D2a），SIFT軟件的預(yù)測分?jǐn)?shù)均為-5.942（圖2b），提示“有損害的”。Clustal X軟件通過對5個人類同源物種的MCM蛋白進(jìn)行保守性比對，結(jié)果 p.Gly427Asp高度保守（圖3），提示這個位點(diǎn)具有重要的生物學(xué)功能。

2.4 突變結(jié)構(gòu)和模型分析 應(yīng)用Swiss-Pdb Viewer軟件進(jìn)行模型構(gòu)建和突變后相互作用對比分析當(dāng)非極性氨基酸Gly427突變?yōu)闃O性氨基酸Asp427后，Asp427側(cè)鏈延長，增加一個與Thr78蘇氨酸的氫鍵作用力（圖4a、b）。

圖1 患兒及其父母MUT基因部分序列測序結(jié)果（a、b、c、d分別是野生型序列、母親、患兒和父親測序結(jié)果）

圖2 p.G427A突變致病性分析圖（a：PolyPhen-2軟件預(yù)測分?jǐn)?shù)設(shè)定在0～1，預(yù)測分?jǐn)?shù)越接近1，越可能為有害突變；b：PROVEAN軟件預(yù)測結(jié)果有害的）

圖3 人427位Gly與不同動物比較

圖4 蛋白三維構(gòu)象分析（a：427位氨基酸野生型；b：427位氨基酸突變型；虛線為氫鍵）。

3 討論

MMA是一種常見的有機(jī)酸代謝遺傳病，臨床癥狀為代謝性酮癥酸中毒，拒食、呼吸困難及生長發(fā)育遲緩等導(dǎo)致新生兒早期死亡或兒童期嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙[6]。國內(nèi)MMA患者60%～80%以MMACHA基因突變引起的合并型MMA居多，cblC缺陷是主要病因[7-8]；其次為單純型MMA，其中MUT基因是最常見突變類型[9]。MUT基因定位于6p21，全長約35 kb，內(nèi)含13個外顯子。MCM酶由MUT基因編碼[10]，是由兩個相同亞基組成的同源二聚體，每個亞基包含32個氨基酸前導(dǎo)序列的750個氨基酸多肽鏈，進(jìn)入線粒體后前導(dǎo)鏈立即被切除，裝配成718個氨基酸的亞單位，每個亞單位包含兩個主要的功能結(jié)合區(qū)：底物結(jié)合區(qū)（第86～423位氨基酸組成）和鈷胺素結(jié)合區(qū)（第578～750位氨基酸組成），兩個結(jié)合區(qū)之間被稱為連接區(qū)（第424～577氨基酸組成），具有關(guān)閉8 barrel結(jié)構(gòu)域的功能。第33～85氨基酸序列參與MCM亞單位二聚體化。本研究對1例經(jīng)血液、尿液氣相色譜/質(zhì)譜串聯(lián)檢查高度懷疑為甲基丙二酸血癥的新生兒家系進(jìn)行了二代測序分析發(fā)現(xiàn)患兒患單純型MMA，MUT基因檢測存在兩處變異，分別為第6號外顯子G427A錯義突變，第9號內(nèi)含子c.1677-1G＞A的剪切突變，為復(fù)合雜合變異。首先研究查詢國內(nèi)外相關(guān)數(shù)據(jù)庫，排除這兩個為多態(tài)性位點(diǎn)，用SIFT和Polyphen2軟件進(jìn)行G427A錯義突變致病性分析為致病突變位點(diǎn)，并提供了氨基酸同源序列保守性分析，蛋白結(jié)構(gòu)分析方法預(yù)測了突變位點(diǎn)帶來的致病性改變。G427A的錯義突變位于MCM酶結(jié)構(gòu)連接區(qū)其改變了氨基酸的空間構(gòu)象進(jìn)而影響蛋白功能，這與Liu等[9]報道相符合，且該位點(diǎn)為我國南方常見突變位點(diǎn)[10-11]。其次，內(nèi)含子剪切位點(diǎn)的突變可造成剪切位點(diǎn)破壞和識別異常，引起前體mRNA的剪切，從而造成基因的異常轉(zhuǎn)錄。根據(jù)剪切位點(diǎn)位置的不同對外顯子所造成的剪切效應(yīng)也不同，突變位于外顯子上游-1bp和-2bp或+1bp和+2bp被稱為是固有剪切位點(diǎn)，可破壞固有剪切位點(diǎn)，造成外顯子完全不識別，最終導(dǎo)致蛋白異常表達(dá)影響蛋白功能，其致病性最強(qiáng)。第9號內(nèi)含子c.1677-1G＞A是典型的固有剪切突變，影響了mRNA的剪切[12]，該剪切突變位點(diǎn)鮮有報道。本例通過氣相色譜/質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)對先證者血液、尿液進(jìn)行了檢測高度懷疑為MMA，通過測序的方法準(zhǔn)確作出MMA分型，位于MUT基因的兩個突變位點(diǎn) c.1280G＞A（p.Gly427Asp）和 c.1677-1G＞A（p.?）是導(dǎo)致單純型MMA的主要原因，該類型屬對維生素B12治療無反應(yīng)型，MMA基因型的分子生物學(xué)診斷有助于對不同類型MMA患者進(jìn)行基因分型，準(zhǔn)確選擇診療方案；同時有助于進(jìn)行家系攜帶者檢測和產(chǎn)前診斷分析[13]，為家庭優(yōu)生優(yōu)育提供具體可行的方向。分子生物學(xué)檢測技術(shù)幫助臨床醫(yī)生提供精準(zhǔn)治療導(dǎo)向，切實(shí)對新生兒遺傳代謝病做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預(yù)、早治療。