外周血單個核細胞自噬相關基因LC3Ⅱ、Beclin-1與類風濕關節炎的相關性研究*

吳 茜，趙莉平，李彥魁，方亞妮，張榮強

陜西中醫藥大學：1.醫學技術學院；2.公共衛生學院，陜西咸陽 712046

類風濕關節炎(RA)是一種慢性關節炎，可導致關節軟骨、骨質破壞并造成功能喪失[1]。這種慢性疾病發病機制復雜，是遺傳、環境、免疫等多種因素共同作用的結果[2]。其中，激活的免疫細胞不斷釋放炎癥介質是導致滑膜持續性炎癥及關節軟骨和骨質破壞的重要原因。因此，在臨床應用中，一方面通過觀察RA患者炎癥相關指標的變化，監測病程進展；另一方面，以抑制及平衡機體炎癥為主要的治療手段，緩解病情[3]。

細胞自噬是指在外界不良環境因素影響下(包括饑餓、氧化應激、感染、營養缺乏)，可被誘導產生并通過一系列途徑將細胞內物質運送到溶酶體中進行降解的過程[4]。近年來研究發現，細胞自噬不僅可以形成自噬小體傳遞吞噬物到溶酶體中，以發揮細胞保護作用，而且它在確保重要免疫細胞行使正常功能及調控炎癥信號等方面同樣扮演著重要角色[4-6]。本研究旨在分析自噬相關基因LC3Ⅱ、Beclin-1在RA患者外周血單個核細胞(PBMC)中相對表達水平的變化，以及其與炎癥因子的相關性，探討細胞自噬在RA患者中的臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年4月至2019年9月陜西中醫藥大學附屬醫院風濕腎病科確診的RA住院患者58例作為RA組。納入標準：(1)符合2010年美國風濕病學會和歐洲抗風濕病聯盟修訂的RA分類標準[7]；(2)無羥氯喹藥物使用史。排除標準：排除患有其他自身免疫性疾病、感染、腫瘤。根據28關節疾病活動度評分(DAS28評分)，將RA組分為活動期組(高、中、低3個疾病活動度亞組，分別為18、11、12例)及緩解期組(17例)。RA組中選取16例初診病例(無羥氯喹藥物治療史)作為治療前組；使用含羥氯喹藥物的治療方案正規治療后，隨訪14例(2例患者失訪)達到臨床緩解期的RA患者作為治療后組。收集同期體檢健康者46例作為健康對照組。RA組和健康對照組的一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

1.2儀器與試劑 Ficoll淋巴細胞(北京索萊寶公司)；Trizol 試劑、反轉錄試劑盒、TB Green Premix Ex TaqⅡ PCR定量試劑盒(日本TaKaRa)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫吸附試驗(ELASA)試劑盒(南京建成生物科技有限公司)；Nano Drop-2000紫外分光光度儀(美國Thermo)；Sure Cycler 8800 熱循環儀(美國安捷倫)；Step One Plus實時熒光定量PCR(qPCR)儀(美國ABI)；全自動酶標儀(美國Bio-TEK)。

表1 RA組和健康對照組一般資料比較

1.3實驗方法

1.3.1臨床及實驗室資料收集及整理 收集RA組患者臨床及實驗室資料，整理到Excel表中。包括(1)患者性別、年齡、體質量指數等一般資料；(2)患者既往史：患病史、用藥史；(3)患者現病史：28 腫脹關節計數(SJC)、28 疼痛關節計數(TJC)、患者全身視覺模擬評分(100-mm VAS)；(4)患者實驗室檢查結果：C反應蛋白(CRP)、紅細胞沉降率(ESR)。利用DAS28評分軟件計算患者DAS28評分。

1.3.2PBMC分離、RNA提取及cDNA合成 使用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管空腹采集靜脈血3 mL，離心分離血漿后，差速密度梯度離心法分離PBMC，Trizol法提取細胞中的總RNA，微量分光光度計檢測RNA濃度、純度[吸光度(A)260/280比值]，將符合標準的RNA樣本統一調整至50 ng/μL，反轉錄為cDNA，于-20 ℃冰箱保存。

1.3.3qPCR qPCR采用核酸染料法，以cDNA為模板，β-actin為內參基因，每個標本做3個復孔，使用Step One Plus qPCR儀進行PCR擴增。引物由TaKaRa公司設計合成，序列見表2。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個循環。基因相對表達水平采用(2-ΔΔCt)表示，其中ΔΔCt = (CtRA組目的基因-CtRA組內參基因)- (Ct健康對照組目的基因-Ct健康對照組內參基因)。

表2 內參基因及目的基因的引物序列

1.3.4TNF-α檢測 使用無抗凝劑采血管采集RA患者3 mL血液，分離血清，ELISA法檢測RA患者TNF-α水平。

2 結 果

2.1RA組PBMC中LC3Ⅱ、Beclin-1 mRNA的相對表達水平 LC3Ⅱ、Beclin-1 mRNA在2組PBMC中均有表達，RA組與健康對照組相比，LC3Ⅱ mRNA相對表達水平顯著升高，差異有統計學意義(t=2.894，P<0.01)，而2組Beclin-1 mRNA相對表達水平差異無統計學意義(t=1.847,P>0.05)。見表3。

表3 RA組及健康對照組PBMCs中LC3Ⅱ、Beclin-1的mRNA相對表達水平比較

2.2LC3Ⅱ、Beclin-1 的mRNA相對表達水平與RA疾病活動度的相關性 活動期組LC3Ⅱ 的mRNA相對表達水平較緩解期組顯著升高(4.31±2.86vs. 0.96±0.81)，差異有統計學意義(t=2.872，P<0.05)；Beclin-1的mRNA相對表達水平沒有顯著變化(1.32±0.67vs. 0.91±0.18)，差異無統計學意義(t=1.186，P>0.05)。

高度活動期組、中度活動期組、低度活動期組、緩解期組中LC3Ⅱ mRNA的相對表達水平比較，差異有統計學意義(F=2.56，P<0.05)，且隨疾病活動度升高，呈上升趨勢。DAS28評分與LC3Ⅱ mRNA相對表達水平呈正相關(r=0.783，P<0.05)。而高度活動期組、中度活動期組、低度活動期組、緩解期組中Beclin-1 mRNA相對表達水平比較，差異無統計學意義(F=0.858，P>0.05)，且與DAS28評分也無相關性(r=0.196,P>0.05)。RA組LC3Ⅱ mRNA相對表達水平與血清中的TNF-α水平呈正相關(r=0.671，P<0.05)，但與CRP水平無相關性(r=0.149,P>0.05)。Beclin-1 mRNA相對表達水平與TNF-α及CRP水平均無相關性(r=0.270、0.151,P>0.05)。RA不同疾病活動度LC3Ⅱ、Beclin-1的mRNA相對表達水平，見圖1。

圖1 RA不同疾病活動度LC3Ⅱ、Beclin-1的mRNA相對表達水平

2.3治療前后組LC3Ⅱ、Beclin-1 mRNA的相對表達水平 與治療前組比較，治療后組LC3Ⅱ、Beclin-1 mRNA相對表達水平顯著下降，差異有統計學意義(t=2.931,P<0.05)。見表4。

表4 RA患者PBMC中LC3Ⅱ、Beclin-1的mRNA在治療前后的相對表達水平比較

3 討 論

細胞自噬是一種維持細胞內環境穩態的生存機制，能夠在各種不同刺激下誘導產生。通過包裹損傷的細胞器、錯誤折疊的蛋白質形成自噬小體，并與溶酶體融合完成內容物的降解，從而避免細胞凋亡，起到保護細胞的作用[8-9]。有研究發現，RA成纖維滑膜細胞的過度增殖與凋亡抵抗有關，而細胞的凋亡抵抗正是由于自噬作用增強，細胞得到保護的結果[10]。

RA作為慢性炎癥性疾病，參與其發病的T細胞(CD4+T淋巴細胞)、B細胞、單核巨噬細胞通過釋放多種細胞因子、直接攻擊靶組織、抗原呈遞、促進破骨細胞分化、形成慢性炎癥環境等方式參與RA疾病進程[11-12]。有研究顯示，RA中的T細胞異常激活，凋亡減少，并且還能保證其他細胞如成纖維滑膜細胞、單核巨噬細胞、B細胞等在慢性炎癥環境中的生存[13]。在本研究中，提取RA患者及健康者的PBMC，比較觀察自噬相關基因LC3Ⅱ及Beclin-1的相對表達水平，發現RA患者LC3Ⅱ mRNA相對表達水平高于健康者，表示外周血PBMC中存在自噬現象，推測T細胞凋亡減少或許與其發生自噬有關。

除細胞保護機制，自噬途徑及相關蛋白在機體免疫和炎性反應中同樣扮演重要角色。通過平衡免疫和炎性反應的利弊效應，自噬作用保護機體免受自身免疫性疾病的傷害[5]。然而，炎性反應和自噬的具體調節機制迄今尚不明晰，蔡永青等[14]研究表示，自噬在炎性反應中通過抑制作用來維持內環境的穩態。有研究發現，自噬與炎癥因子可互相調節，一方面，炎癥因子調節自噬，誘導或抑制細胞自噬；另一方面，自噬反過來可以調節炎癥因子的產生和釋放[15]。RA患者可通過疾病活動度反映機體炎癥情況，臨床上通常用DAS28評分進行評估。本研究在探索自噬與炎癥關系中發現，LC3Ⅱ mRNA相對表達水平與疾病活動度呈正相關。LC3Ⅱ mRNA可作為反映疾病活動度的指標監測RA患者的病情。另外，研究顯示，TNF-α作為重要的炎癥因子參與RA的發生、發展，并與疾病活動度呈正相關[16]。本研究也對LC3Ⅱ mRNA相對表達水平與TNF-α的相關性進行分析，發現LC3Ⅱ mRNA相對表達水平與TNF-α呈正相關。因此，可進一步證實機體炎癥情況與自噬水平有相關性，但炎癥因子與自噬二者是單方面作用還是互為因果還需繼續深入研究。

在腫瘤治療中，已提出以自噬作為治療靶點干預疾病的進程[17]。RA同樣存在自噬現象，推測通過抑制自噬可緩解病情。羥氯喹是抑制自噬的有效藥物[18]，在研究中選擇RA初診患者(未使用羥氯喹)進行正規治療(治療藥物中有羥氯喹)，比較治療前后RA患者自噬水平，結果顯示LC3Ⅱ mRNA相對表達水平在治療后下降，推測自噬活性的降低可緩解病情。但是，在臨床治療過程中難以使用單一藥物進行干預，其他藥物造成的影響無法判斷。因此，自噬作為有效治療靶點仍需通過細胞或動物模型，控制單因素進行驗證。

綜上所述，從RA患者和治療前后自噬相關基因的相對表達水平，及其與疾病活動度和炎癥介質相關性分析結果表明，自噬水平在活動期RA患者中升高，且與疾病活動度及機體炎癥情況呈正相關。自噬相關基因LC3Ⅱ作為評價RA疾病活動度和治療效果的指標之一，為臨床監測病情及療效提供幫助。同時，本研究也為探索自噬、炎癥、RA三者之間的關系提供一定依據，課題組將針對三者之間的具體作用機制展開進一步的研究。