非侵入性生物標志物微小RNA在感染性疾病中的研究進展*

謝可心，李福興，張玉琳 綜述，趙衛東 審校

大理大學臨床醫學院，云南大理 671000

微小RNA(miRNA)是一種小的內源性非編碼單鏈RNA分子，長度為18～22個核苷酸，通過與特定的信使RNA(mRNA)3′非翻譯區(3′UTR)結合，導致mRNA降解或翻譯抑制，從而對基因進行轉錄后的表達調控[1]。研究表明，人類基因組中miRNA基因僅占人類基因組的3%左右，卻可調節高達60%的蛋白質編碼基因，并參與細胞凋亡、增殖、分化和轉移等生物學過程[2]。

據研究，miRNA在心臟、肝臟和腎臟等器官損傷時會被釋放出來，其相對表達水平的變化會引起心血管疾病、阿爾茨海默病、惡性腫瘤等疾病[3]。由于循環miRNA在體液中易獲得，且具有穩定性高等優勢，成為目前研究的重點。近年來，在感染性疾病中 miRNA的表達得到廣泛的研究。當病原微生物感染宿主后，宿主會利用原發性或繼發性免疫應答來清除和殺滅病原微生物，而病原微生物也會利用宿主基因組中的某些特定miRNA，改變miRNA的表達模式來改變自身生存環境，以利于病原微生物的生存、復制和傳播，從而導致感染相關疾病的發生和發展。本文對miRNA在感染性疾病中的研究進展進行綜述。

1 miRNA與細菌感染

1.1miRNA與膿毒癥 miRNA已被證明是一種潛在的膿毒癥生物標志物。研究發現，與健康對照者相比，膿毒癥患者miR-223[4]、miR-155[5]等表達升高，而miR-10a[6]的表達降低。不同細菌感染時，miRNA的表達同樣有差異。MA等[7]發現，miR-128過表達可以抑制金黃色葡萄球菌誘導的巨噬細胞炎性反應。與健康對照者相比，6個miRNA在銅綠假單胞菌感染患者外周血單個核細胞中的表達有顯著差異[8]。此外，動物模型表明miRNA參與膿毒癥的病理過程。在脂多糖誘導的小鼠模型中，miR-15a-5p可能通過激活核因子κB(NF-κB)途徑，上調腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導蛋白3相互作用蛋白2(TNIP2)的表達，參與膿毒癥的炎癥過程[9]。因此，這些miRNA可作為生物標志物為膿毒癥的診斷提供一個新思路，從而為膿毒癥早期抗感染治療提供依據。然而，盡管進行了多年的研究，仍然沒有就膿毒癥患者循環中miRNA臨床應用分析的最佳標準化策略達成共識。這很可能是由于在膿毒癥患者的不同隊列中存在顯著的miRNA調節模式的差異，缺乏標準化樣本收集及數據規范化分析等。

1.2miRNA與結核 在結核分枝桿菌感染時，特定miRNA的表達會發生變化。ZHANG等[10]通過生物信息學分析證明，miR-892b、miR-199B-5p和miR-582-5p可作為活動性肺結核新的診斷標志物。此外，不同治療階段的結核病患者血清中miRNA的表達也不同，其中miR-21-5p可區分治愈和未經治療的肺結核患者[11]。NIU等[12]通過建立細胞模型，發現miR-147b通過C11orf87軸介導的PI3K/AKT途徑來調控巨噬細胞在體外的增殖和遷移。越來越多的證據表明miRNA是眾多以不同方式參與結核分枝桿菌發病和宿主反應的遺傳因子之一。通過降低或增加特定miRNA的表達，進而抑制或激活其控制的基因，可以預防結核病的進展甚至可以作為治療靶點應用于臨床。

1.3miRNA與幽門螺桿菌 很多miRNA被認為與幽門螺桿菌相關胃癌的發生、發展密切相關。與胃炎患者相比，胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤患者胃中miR-150、miR-155、miR-196A、miR-138的表達上調，miR-153、miR-7的表達下調，并在小鼠模型中得到驗證[13]。在幽門螺桿菌感染導致胃癌的發病機制中，有研究發現宿主基因TRPM3啟動子的異常甲基化，使胃癌患者的miR-204表達下調，在胃癌細胞模型中，miR-204抑制TNF-α誘導的NF-κB信號通路的激活，并在動物模型中抑制腫瘤的生長和轉移[14]。幽門螺桿菌與多種miRNA在不典型增生、萎縮、消化性潰瘍、腸化生、胃炎及其他胃腸道疾病中的分子機制需進一步研究，探討幽門螺桿菌對胃癌和其他胃腸道疾病發生、發展過程中不同抑癌基因miRNA相對表達水平的變化，將為臨床提供更多信息。

2 miRNA與病毒感染

2.1miRNA與病毒性肝炎 miRNA的異常表達與病毒性肝炎的發生密切相關。高通量測序研究表明，miR-522和miR-523在乙型肝炎病毒陽性的肝細胞癌患者中過表達，且與遠期預后顯著相關[15]。最新的研究表明，miR-224與慢性丙型肝炎的脂肪變性相關，同時miR-101可能通過下調PI3K/Akt/mTOR途徑在慢性丙型肝炎中起抗纖維化作用[16]。肝炎病毒感染的過程和相關的肝損傷取決于多種因素，如病毒的遺傳變異性，以及宿主與病毒的相互作用。如何利用miRNA調控肝炎病毒的表達，早期診斷和識別能預防其發展成致命的并發癥，如肝硬化和肝癌，將成為改善預后、抗病毒和抗腫瘤治療的新方式。

2.2miRNA與獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS) miRNA參與AIDS的發生、發展過程。人類免疫缺陷病毒(HIV)據其亞種、傳染性、毒性及其流行程度分為2組，HIV-1比HIV-2更具感染性和毒性。有報道稱HIV-1感染人體的過程受miRNA的影響，通過直接作用于病毒基因組或編碼復制病毒所需的宿主細胞蛋白來調節HIV-1的感染和復制[17]。近年來，人們發現miRNA及其表達在AIDS不同時期可能存在差異。如在AIDS病毒感染的急性期，miR-3162-3p在血漿中表達下調，在原始CD4 T細胞中，miR-124a、miR-29a和miR-223等表達上調，而促進病毒進入細胞的miR-125b表達下調[18]。雖然標準檢測方法在檢測低病毒載量等方面存在局限性，但監測miRNA可為診斷和預測AIDS進展提供有價值的信息。隨著高靈敏度檢測技術和高通量測序技術的發展，miRNA可作為一種成本較低的疾病診斷方法，有望為HIV感染者帶來新的希望。

2.3miRNA與流感 miRNA在流感病毒的感染進程中起關鍵作用。微陣列分析H1N1甲型流感病毒(IVA)患者外周血中miRNA的表達譜發現，IVA患者外周血中miR-132-3p的表達上調，而miR-132-3p過表達會抑制IVA激活的干擾素α和IFN-β的產生，從而促進IVA的復制[19]。此外，miR-324-5p通過靶向H5N1的PB1病毒RNA來抑制H5N1的復制，通過靶向JAK1-STAT3途徑負調控細胞的CUEDC2基因，增強Ⅰ型干擾素、Ⅲ型干擾素和干擾素誘導基因的表達，隨后抑制H5N1病毒復制[20]。宿主miRNA直接或間接靶向病毒基因以調節感染期間的先天免疫反應和病毒復制?；趍iRNA的特性，研究那些既能降解流感病毒RNA又能減輕病毒誘導炎性反應的miRNA，可以開發出新一代的流感疫苗。總之，特異miRNA是一種潛在的診斷標志物和臨床治療工具。

2.4miRNA與冠狀病毒肺炎 miRNA參與冠狀病毒的感染進程。在機體的固有免疫中，Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)起抗病毒作用。有研究發現，冠狀病毒可通過miR-30a-5p/SOCS 軸來拮抗Ⅰ型干擾素的抗病毒作用[21]。LI等[22]研究發現，Gga-miR-30d過表達可抑制冠狀病毒的復制。DICKEY等[23]在研究冠狀病毒誘發的神經系統疾病的小鼠模型中發現，miR-155可增強T細胞運輸及抗病毒的能力。降低宿主特異性miRNA的水平可能會促進病毒的復制，從而導致宿主免疫系統對病毒的免疫識別和清除。然而，由于對miRNA功能的干預可能導致免疫功能受損或其他不可預見的生物異常，需要謹慎對待。此外，在冠狀病毒感染細胞內使用特異性的拮抗劑進一步沉默miRNA，可能成為miRNA參與疾病病原學的另一種治療策略。

3 miRNA與真菌

miRNA在宿主與真菌的相互作用中起調節作用。研究發現，miR-146a通過編碼白細胞介素1受體相關激酶1(IRAK1)和TNF受體相關因子6(TRAF6)，負向調節NF-κB的活化，從而抑制炎性細胞因子的釋放，故miR-146a可作為新型隱球菌感染的治療手段[24]。在念珠菌感染的小鼠模型中，miR-146a、miR-155、miR-455和miR-125a表達上調[25]。由于真菌感染而引起的不同循環miRNA相對表達水平的變化，可以通過不同的技術在循環中進行定量或檢測，這些技術將為miRNA作為真菌感染的潛在生物標志物。

4 miRNA與肺炎支原體

肺炎支原體肺炎(MPP)的發病機制可能與miRNA有關。實時熒光定量PCR檢測36例MPP患兒外周血發現，miR-222-3p在MPP患兒血漿中相對表達水平明顯高于健康對照者，使用肺炎支原體脂質相關膜蛋白(LAMP)刺激THP-1細胞和小鼠，發現LAMP刺激后，THP-1細胞的miR-222-3p相對表達水平呈劑量依賴性增加；同時，在LAMP刺激下小鼠的細支氣管周圍有大量炎癥細胞浸潤，支氣管肺泡灌洗液中的miR-222-3p相對表達水平增加[26]。此外，LI等[27]研究發現，MPP患兒血清miR-29c相對表達水平明顯低于健康對照者，而SB7-H3和白細胞介素17水平明顯高于健康對照者，研究發現B7-H3是miR-29c的直接靶點，miR-29c的沉默或過表達可上調或下調THP-1細胞中B7-H3的表達。以上研究均表明，miRNA與MP感染密切相關，雖然目前的研究大都集中在對其表達差異的分析上，關于其在MPP中的作用機制研究較少，但這為以后進一步研究miRNA在MP感染中的作用機制奠定了基礎，使miRNA成為診斷疾病新的、有潛力的生物標志物成為可能。

5 miRNA與沙眼衣原體

miRNA在沙眼衣原體感染中的作用成為近年來研究的熱點。微陣列分析結果顯示，miR-147b和miR-1285在炎性沙眼瘢痕形成中表達上調[28]。在生殖道感染小鼠模型中發現，感染后第6天miR-125b-5p、miR-16等表達顯著下調，而miR-146和miR-451表達顯著上調[29]。此外，發現再次感染后生殖道中miRNA表達譜不同，相對表達水平也增高。這些研究提示在衣原體感染過程中miRNA在調節抗衣原體保護性免疫中起著至關重要的作用，表明某些miRNA可能成為有意義的診斷性生物標志物，也可能為未來疫苗研制提供幫助。

6 miRNA與梅毒螺旋體

有研究證明miRNA在梅毒螺旋體感染過程中參與細胞的免疫反應。在綜合分析中，鑒定出74個差異表達的miRNA，經實時熒光定量PCR證實，hsa-miR-195-5p、hsa-miR-223-3p、hsa-miR-589-3p在梅毒螺旋體血清學陽性和梅毒螺旋體治愈患者中有顯著差異，其中hsa-miR-195-5p在未經治療的梅毒螺旋體患者和健康對照者之間差異有統計學意義，首次證實梅毒螺旋體感染不同階段外周血單個核細胞中miRNA的差異表達[30]。此外，梅毒螺旋體刺激的巨噬細胞來源的外泌體表達高水平的miR-146a-5p，并通過連接黏附分子來減少單核細胞通過內皮的遷移[31]。miRNA表達譜的改變可能通過調控靶基因或信號通路與免疫耐受，其與持續性梅毒感染相關，說明miRNA具有作為梅毒螺旋體感染的非侵入性生物標志物的巨大潛力，這將有助于更好地診斷和治療梅毒螺旋體感染。

7 miRNA與立克次體

立克次體通過調節miRNA調控宿主基因的表達。微陣列方法分析感染3 h或24 h的人微血管內皮細胞miRNA的差異表達，其中miR-129-5p、miR-200a-3p、miR-297、miR-200b-3p和miR-595被鑒定為前5種上調的miRNA，miR-301b-3p、miR-548a-3p和miR-377-3p被鑒定為前3種下調的miRNA[32]。SAHNI等[33]研究發現，在立克次體感染的人微血管內皮細胞中miR-424和miR-503的表達顯著下調，進而促進高水平的成纖維細胞生長因子受體1的表達，促進病原體的侵入及傳播，隨后在小鼠感染模型中得到證實。因此，特異性的miRNA可能參與宿主-病原體相互作用和病理生理學過程，為開發新的立克次體感染的診斷或治療方法提供依據。

8 miRNA與寄生蟲感染

8.1miRNA與瘧疾 瘧原蟲能改變紅細胞miRNA在血液中的表達。使用微陣列方法確定了5個上調的miRNA(miR-3135b、miR-6780b-5p、miR-1246、miR-6126和miR-3613-5p)可以作為成年輸入性惡性瘧疾預測、預后及嚴重程度的潛在血液生物標志物[34]。在小鼠模型中，比較未感染、嚴重但非腦型瘧疾和腦型瘧疾小鼠大腦中miRNA的表達發現，每組小鼠中miRNA的表達均不同。此外，有研究證明，某些miRNA參與了與腦型瘧疾相關的轉化生長因子-β信號通路及細胞內吞途徑[35]。因此，這些miRNA可能代表宿主的免疫狀態，作為成年輸入性惡性瘧疾診斷的強有力的非侵入性生物標志物及治療靶點。但是，對miRNA在瘧疾感染中的作用認識還不夠。進一步的研究可能會有助于使用這些小分子來識別患有嚴重瘧疾的患者，并促進治療決策。

8.2miRNA與血吸蟲病 miRNA與血吸蟲病的發病機制密切相關。在感染日本血吸蟲的患者和健康對照者的肝臟組織中發現，hsa-miR-150-5-p、hsa-miR10a-5p、hsa-miR-199-a-3-p等通過作用于代謝、細胞外基質蛋白、脂質動員和限制氧化損傷應激而在血吸蟲肝纖維化中發揮重要作用[36]。在小鼠模型實驗中發現，血吸蟲來源的miRNA參與疾病的多種病理途徑。如來自寄生蟲的Sja-miR-1存在于感染小鼠肝星狀細胞中，并通過靶向分泌的跨膜受體相關蛋白1上調膠原和α平滑肌肌動蛋白A的表達，促進小鼠血吸蟲肝纖維化的發生[37]。這些研究提示miRNA可作為診斷血吸蟲病肝臟病理的候選生物標志物和治療血吸蟲病相關肝纖維化新的治療靶點。

9 總 結

綜上所述，循環miRNA作為感染性疾病的新型生物標志物已經成為研究的焦點。這是由于循環miRNA表現出高度的穩定性，但在各種感染性疾病中的表達往往是異常的，并且可以被現有的分子生物學技術檢測到。遺憾的是，在臨床應用中仍存在許多障礙。首先，miRNA譜在一個特定的群體中并不完全相同，并且許多miRNA是個體依賴的。大部分在體外進行的研究證實了其作為生物標志物的潛力，然而，需要在體內和臨床試驗中進一步確認其結果。其次，缺乏分離和鑒定特異性miRNA的標準化方法。目前，檢測循環miRNA的方法主要有高通量測序法、miRNA芯片法、Northern blot法、實時熒光定量PCR法。其中高通量測序法價格昂貴，難以在實驗和臨床中普及；Northern blot法步驟繁瑣且需要大量的RNA輸入，給miRNA的定量帶來了困難；實時熒光定量PCR是研究miRNA最常用的方法，操作簡便、快速，且具有較高的靈敏度和特異度，有助于循環miRNA的鑒定。然而，血漿或血清中的檢測、離心參數、用于血液收集的抗凝血劑、RNA提取和擴增方法及患者分層的不同方法等幾個變量的存在，決定了miRNA表達檢測的可變性。這就需要對檢測miRNA的方法學進行強有力的驗證并加以標準化。同時需要建立規范的大數據分析和管理體系進行數據解釋。此外，需要排除外部因素的干擾。如在實驗過程中，需要采取額外的預防措施，以避免實驗污染；miRNA的檢測及鑒定應該由具有豐富分子生物學和生物信息學知識的有經驗的研究人員來完成。盡管miRNA在感染性疾病的發病機制、診斷及治療中的重要性越來越受到廣大科研工作者和臨床醫生的關注，并且發現某些特異的miRNA越來越多地被用于診斷中，但其仍處在研究的初期階段。為了提高感染性疾病診斷的準確性和高效性，仍需要更多的研究來明確這些生物標志物在感染性疾病中是如何發揮作用的，從而提高miRNA在診斷感染性疾病中的靈敏度和特異度，明確生物標志物對感染性疾病診斷及治療的價值。盡管目前研究存在局限性，相信隨著研究的不斷深入，miRNA在感染性疾病的診斷、監測、治療與預防中的地位將日益顯著。