云南地區(qū)腫瘤患者CRE菌株的表型篩選與耐藥基因相關(guān)性研究*

楊曉芳，杜 艷，楊 偉，張 曦

1.云南省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650118;2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650118

碳青霉烯類(lèi)耐藥腸桿菌科細(xì)菌(CRE)臨床治療失敗率高，病死率高，嚴(yán)重威脅患者健康。CRE耐藥機(jī)制最常見(jiàn)的是產(chǎn)碳青霉烯酶，2017年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)推薦采用改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)(mCIM)檢測(cè)碳青霉烯酶，但是其不能區(qū)分酶的類(lèi)型，2018年CLSI又加入了乙二胺四乙酸(EDTA)碳青霉烯類(lèi)滅活試驗(yàn)(eCIM)，與mCIM聯(lián)合，用于區(qū)分腸桿菌科中產(chǎn)金屬酶和絲氨酸碳青霉烯酶的菌株[1]，這對(duì)于臨床用藥有非常重要的指導(dǎo)意義。用藥習(xí)慣的不同使不同時(shí)期、不同地域CRE的臨床感染特點(diǎn)和耐藥性各有差異，腫瘤患者是CRE的易感人群，一旦發(fā)生CRE感染，后果十分嚴(yán)重。有研究顯示，腫瘤醫(yī)院耐藥菌的檢出率高于綜合性醫(yī)院[2]，還有研究發(fā)現(xiàn),使用了大劑量化療藥物的患者,長(zhǎng)期應(yīng)用廣譜抗菌藥物后,其醫(yī)院感染率高達(dá)20%，說(shuō)明腫瘤患者的耐藥情況有別于一般患者[3]。本研究選取云南省腫瘤醫(yī)院腫瘤患者分離的CRE菌株，進(jìn)行mCIM與eCIM表型篩選，并與耐藥基因進(jìn)行比較，明確表型篩選試驗(yàn)在腫瘤患者當(dāng)中的臨床適用度，為CRE院內(nèi)感染的防控和優(yōu)化臨床用藥提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集2015年1月至2018年12月云南省腫瘤醫(yī)院臨床科室送檢的31株CRE，菌株采用法國(guó)生物梅里埃公司生產(chǎn)的全自動(dòng)微生物鑒定與藥敏分析系統(tǒng)VITEK-2及其配套的GN卡、AST-GN14卡進(jìn)行檢測(cè)，分離出至少對(duì)亞胺培南(IPM)、美羅培南或厄他培南中的一種耐藥的腸桿菌科細(xì)菌，定義為CRE。收集到的31株菌株分離提純后紙片法留菌凍存于-80 ℃冰箱。質(zhì)控菌株：肺炎克雷伯菌ATCCBAA1705、ATCCBAA1706、ATCCBAA2146。

1.2試劑與儀器 美羅培南藥敏紙片購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；TSB干粉購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司；PCR所用試劑、瓊脂糖、5×TBE、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、凝膠染色試劑(GelRed)、引物均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；乙二胺四乙酸二鉀購(gòu)自上海試劑一廠(chǎng)；哥倫比亞血瓊脂平板、MH瓊脂平板購(gòu)自鄭州安圖生物工程股份有限公司；Vitek-2全自動(dòng)微生物鑒定與藥敏分析儀購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司；恒溫金屬浴(HB120-S)購(gòu)自大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ViiA7 Dx)購(gòu)自美國(guó)ABI公司；電泳儀(power pac200)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3方法

1.3.1菌種復(fù)蘇 取出凍存于-80 ℃冰箱中的細(xì)菌恢復(fù)至室溫，用無(wú)菌鑷子夾取適量沾有細(xì)菌的紙片分區(qū)劃線(xiàn)接種于血瓊脂平板，平板上做好標(biāo)記后放于37 ℃孵箱中孵育18～20 h。

1.3.2mCIM與eCIM聯(lián)合檢測(cè) 31株菌株均進(jìn)行mCIM與eCIM聯(lián)合檢測(cè)，操作及結(jié)果判讀嚴(yán)格按照2018年CLSI-M100文件執(zhí)行[1]。

1.3.3碳青霉烯酶基因檢測(cè) 煮沸法提取細(xì)菌DNA模板，PCR擴(kuò)增碳青霉烯酶類(lèi)耐藥基因，包括blaKPC-2、blaSME、blaNDM-1、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48共6種[4]，見(jiàn)表1。PCR 擴(kuò)增體系為25 μL：2×Tap PCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L )各1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min(blaKPC-2為94 ℃ 3 min，blaIMP和 blaVIM為94 ℃ 5 min)； 94 ℃變性45 s(blaNDM-1為94 ℃ 30 s)，55 ℃退火45 s(blaKPC-2為56 ℃ 45 s，blaNDM-1為63 ℃ 30 s，blaIMP為53 ℃ 45 s)，72 ℃延伸1 min(blaNDM-1為72 ℃ 45 s)，30個(gè)循壞；72 ℃終延伸 10 min(blaNDM-1為72 ℃ 3 min)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外凝膠成像儀觀察結(jié)果。

表1 碳青霉烯酶基因PCR擴(kuò)增引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以PCR結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，計(jì)算 mCIM和eCIM檢測(cè)的靈敏度和特異度，并分別與基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性分析，其中Kappa 0.0～0.20為極低一致，>0.20～0.40為一般一致；>0.40～0.60為中等一致，>0.60～0.80為高度一致，>0.80～1.00為幾乎完全一致。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1菌株信息 云南省腫瘤醫(yī)院CRE菌株以肺炎克雷伯菌(15株，占48.4%)為主，其次依次為大腸埃希菌7株，陰溝腸桿菌3株，產(chǎn)酸克雷伯菌和弗氏檸檬酸桿菌各2株,產(chǎn)氣腸桿菌和克氏檸檬酸桿菌各1株。31株CRE分離自8種不同類(lèi)型的標(biāo)本，其中尿液12例，體液9例，痰3例，血2例，咽拭子2例，腦脊液、分泌物、引流液各1例，其中尿液標(biāo)本所占比例最高(38.7%)。感染年齡多集中在中老年人群，40歲以下患者僅1例(3.2%)，60歲以上患者14例(45.2%)。科室分布主要集中在外科，其中重癥醫(yī)學(xué)科7株,泌尿外科7株,神經(jīng)外科5株，腹部外科5株，結(jié)直腸外科2株，放射治療科、姑息醫(yī)學(xué)科、骨科、微創(chuàng)介入科、胸外科各1株。直腸癌、膀胱癌、顱內(nèi)腫瘤是分離CRE最多的3種腫瘤類(lèi)型。

2.2mCIM與eCIM檢測(cè) 31株CRE中，mCIM檢測(cè)陽(yáng)性27株(87.1%)，eCIM檢測(cè)陽(yáng)性20株(64.5%)，不解釋的有4株(12.9%)。mCIM和eCIM聯(lián)合檢測(cè)判斷為絲氨酸碳青霉烯酶7株(22.6%)，金屬酶20株(64.5%)，碳青霉烯酶陰性4株(12.9%)。

2.3耐藥基因檢測(cè)情況 31株CRE菌株中，26株檢出碳青霉烯酶耐藥基因，陽(yáng)性率為83.9%。31株CRE菌株包括11株blaKPC-2基因(陽(yáng)性率35.5%),12株blaNDM-1基因(陽(yáng)性率38.7%),2株blaIMP基因(陽(yáng)性率6.5%)，1株同時(shí)擴(kuò)增出blaKPC-2和blaNDM-1基因(3.2%)，5株未擴(kuò)增出6種耐藥基因(16.1%)，blaSME、blaVIM、blaOXA-48 3種耐藥基因經(jīng)PCR檢測(cè)均為陰性。肺炎克雷伯菌以blaKPC-2基因型為主(10株)，占肺炎克雷伯菌的66.7%;大腸埃希菌以blaNDM-1基因型為主(5株)，占大腸埃希菌的71.4%。

2.4mCIM、eCIM表型篩選與耐藥基因的相關(guān)性 26株碳青霉烯酶基因陽(yáng)性菌株中，mCIM 檢測(cè)全部為陽(yáng)性。以PCR檢測(cè)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”，mCIM檢測(cè)碳青霉烯酶的靈敏度和特異度分別為100.0%、80.0%，與PCR檢測(cè)的一致性程度為“幾乎完全一致”(Kappa=0.870，P<0.001)；eCIM檢測(cè)金屬酶的靈敏度和特異度分別為100.0%、53.8%，與PCR檢測(cè)的一致性程度為“中等一致”(Kappa=0.518，P<0.001)；mCIM聯(lián)合eCIM檢測(cè)碳青霉烯酶總的靈敏度和特異度分別為73.1%、80.0%，檢測(cè)絲氨酸碳青霉烯酶的靈敏度為50.0%，檢測(cè)金屬酶的靈敏度為100.0%，與PCR檢測(cè)的一致性程度為“高度一致”(Kappa=0.624，P<0.001)。有1株弗氏檸檬酸桿菌耐藥基因檢測(cè)為陰性，但mCIM為陽(yáng)性。1株同時(shí)含有 KPC-2和NDM-1基因型的菌株mCIM為陽(yáng)性，eCIM 為陰性。有6株基因型為KPC-2的肺炎克雷伯菌eCIM檢測(cè)為陽(yáng)性。見(jiàn)表2、3。

表2 31株CRE碳青霉烯酶基因檢測(cè)和mCIM、eCIM結(jié)果分布(n)

表3 mCIM聯(lián)合eCIM與PCR檢測(cè)結(jié)果判讀的比較(n)

3 討 論

近30年來(lái)，CRE流行足跡已遍布美洲、歐洲、亞洲、非洲等多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，在我國(guó)，CRE的流行情況同樣十分嚴(yán)峻。全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(1 307家醫(yī)院)數(shù)據(jù)顯示CRE的檢出率逐年上升，碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌檢出率從2013年的4.9%上升至2017年的9.0%，且CRE檢出呈現(xiàn)地域性差異，2017年CRE檢出率在上海市和河南省高達(dá)25.0%以上[5]。可見(jiàn)，CRE 菌株的迅速蔓延是國(guó)內(nèi)外共同面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

美國(guó)9個(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)mCIM進(jìn)行評(píng)估，表明其檢測(cè)碳青霉烯酶的靈敏度和特異度均達(dá)到90%以上[6]。本研究mCIM檢測(cè)的陽(yáng)性率為87.1%，檢測(cè)碳青霉烯酶的靈敏度達(dá)到了100.0%，與相關(guān)文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[6-10]，但特異度低于有關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道[6，8，11-13]。mCIM與PCR檢測(cè)的一致性程度為“幾乎完全一致”(Kappa=0.870，P<0.001)，與馬玉蘭等[8]報(bào)道的一致性程度相符(Kappa=0.851)。本研究mCIM特異度偏低，推測(cè)可能的原因?yàn)椋?1)菌株總數(shù)及基因陰性菌株數(shù)量較少，存在標(biāo)本數(shù)量的差異性。(2)PCR擴(kuò)增只能對(duì)已知的編碼基因進(jìn)行檢測(cè)，若該菌株存在少見(jiàn)或未知的耐藥基因則會(huì)導(dǎo)致碳青霉烯酶基因檢測(cè)結(jié)果呈假陰性。TAMMA等[14]對(duì)11種碳青霉烯酶表型篩選方法針對(duì)產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌的篩選能力進(jìn)行了比較，研究表明mCIM試驗(yàn)對(duì)KPC、NDM、IMP基因型的靈敏度分別為98%、100%、83%。ZHOU等[15]研究報(bào)道顯示，mCIM檢測(cè)的靈敏度均>98%，而本研究中3種基因型的靈敏度均為100%，說(shuō)明mCIM對(duì)于腫瘤患者KPC、NDM、IMP基因型也具有較高的靈敏度。

本研究結(jié)果顯示，eCIM對(duì)于KPC-2基因型的鑒別能力不足，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)引起重視。雖然張凡等[9]、馬玉蘭等[10]的研究中也發(fā)現(xiàn)KPC-2基因型為陽(yáng)性同時(shí)eCIM 也為陽(yáng)性的菌株。筆者查閱文獻(xiàn)推測(cè)可能的原因?yàn)椋?1)菌株間存在地區(qū)差異性及腫瘤患者自身用藥問(wèn)題；(2)eCIM本身方法學(xué)問(wèn)題：①EDTA 對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)也有一定抑制作用，可能通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性導(dǎo)致對(duì)抗菌藥物敏感；②EDTA 對(duì)少量絲氨酸碳青霉烯酶，如 KPC、OXA-48 等，也存在抑制現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。但EDTA對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制作用對(duì)eCIM結(jié)果影響有多大及多少劑量的EDTA可以引起假陽(yáng)性結(jié)果還有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。本研究有1株同時(shí)含有KPC-2和NDM-1基因型的菌株eCIM為陰性，馬玉蘭等[10]的研究也發(fā)現(xiàn)3株同時(shí)含有KPC-2和 NDM-1基因型的菌株eCIM為陰性，這與相關(guān)研究結(jié)果一致[1]，eCIM陰性結(jié)果不能排除金屬酶的可能性，菌株可能同時(shí)含有2種耐藥基因。

通過(guò)Kappa一致性比較分析發(fā)現(xiàn)，mCIM、eCIM在云南地區(qū)腫瘤患者中與耐藥基因有高度的一致性，聯(lián)合檢測(cè)能同時(shí)區(qū)分碳青霉烯酶的類(lèi)型，且該方法操作簡(jiǎn)便，不需要特殊儀器，成本低廉，值得推廣使用。

本研究肺炎克雷伯菌以blaKPC-2基因型為主，大腸埃希菌以blaNDM-1基因型為主。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)耐碳青霉烯酶的大腸埃希菌的研究報(bào)道較少，本研究雖然大腸埃希菌只有7株，卻發(fā)現(xiàn)5株均為blaNDM-1基因型，故本研究對(duì)于臨床用藥有指導(dǎo)意義，提示可以根據(jù)檢出菌的種類(lèi)來(lái)指導(dǎo)用藥，如果為大腸埃希菌，可優(yōu)先考慮對(duì)金屬酶有效的藥物，新型抗菌藥物頭孢他啶/阿維巴坦可能無(wú)效，同時(shí)應(yīng)提高對(duì)此類(lèi)菌的院內(nèi)感染監(jiān)測(cè)，防止耐藥菌的傳播。

本研究中老年人更易感染CRE，老年患者由于臟器功能減退及自身免疫力下降，是感染的高危人群，在CRE的防治中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注老年人。本研究CRE分布最多的科室是重癥醫(yī)學(xué)科，這與重癥醫(yī)學(xué)科患者大多感染重及臟器功能弱有關(guān)。本研究中尿液標(biāo)本所占比例最大，可能因?yàn)椴糠帜[瘤患者長(zhǎng)期留置導(dǎo)尿管，增加了病原菌的感染機(jī)會(huì)，所以在臨床診治過(guò)程中應(yīng)注意及時(shí)更換或者拔除尿管，減少不必要的有創(chuàng)操作，以免引起多重耐藥菌的感染。