p16/Ki-67細(xì)胞雙染對(duì)HR-HPV陽(yáng)性的宮頸高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變的預(yù)測(cè)價(jià)值*

東 蓓，周素芳，張 璇

蘇州高新區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江蘇蘇州 215129

宮頸癌在發(fā)展中國(guó)家病死率較高，及時(shí)診治宮頸高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)在一定程度可預(yù)防該病[1-3]。宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變(SIL)與高危型人乳頭狀瘤病毒(HR-HPV)感染密切相關(guān)[4-8]。

目前，臨床初篩SIL主要采取宮頸液基細(xì)胞薄層技術(shù)(TCT)和HR-HPV檢測(cè)，但均存在不足[9]。TCT特異度高，靈敏度低，缺乏統(tǒng)一的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。HR-HPV檢測(cè)靈敏度高，特異度低，不能預(yù)判宮頸病變及程度。p16/Ki67相對(duì)表達(dá)水平與宮頸病變級(jí)別具有直接相關(guān)性，p16/Ki-67細(xì)胞雙染特異度高,靈敏度與HR-HPV近似，具有良好的應(yīng)用前景。本研究對(duì)HR-HPV陽(yáng)性者進(jìn)行p16/Ki-67細(xì)胞雙染、TCT檢測(cè)及陰道鏡下宮頸活檢，探討p16/Ki-67細(xì)胞雙染對(duì)HSIL的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年7月至2019年7月在本院門診接受宮頸癌篩查HR-HPV檢測(cè)陽(yáng)性患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)HR-HPV陽(yáng)性；(2)患者同意該研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往接受過(guò)SIL或?qū)m頸癌治療；(2)合并其他惡性腫瘤；(3)合并妊娠；(4)患者拒絕簽署知情同意書。該研究已獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：[2016]第013號(hào))。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)方案 根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，受試者均進(jìn)行p16/Ki-67細(xì)胞雙染、TCT及陰道鏡下宮頸活檢。

1.2.2HR-HPV檢測(cè) 宮頸脫落細(xì)胞用多功能SLAN-96 S醫(yī)用PCR系統(tǒng)(上海宏石公司)進(jìn)行HR-HPV DNA檢測(cè)，包括13種HR-HPV型別，分別為HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型。根據(jù)試劑說(shuō)明進(jìn)行檢測(cè)，HR-HPV任一型別陽(yáng)性即診斷為HR-HPV陽(yáng)性。

1.2.3p16/Ki-67細(xì)胞雙染檢測(cè) 收集的宮頸脫落細(xì)胞保存至盛有新柏氏的瓶中，采用ThinPrep 2000系統(tǒng)(美國(guó)Hologic公司)進(jìn)行處理。采用p16/Ki-67檢測(cè)試劑盒(亞能生物公司)，根據(jù)試劑說(shuō)明進(jìn)行染色并判讀結(jié)果。研究結(jié)果由專業(yè)檢驗(yàn)技師進(jìn)行觀察、分析，并將顯微鏡下的觀察畫面以圖片方式進(jìn)行保存和記錄。p16/Ki-67細(xì)胞雙染將p16陽(yáng)性定義為胞質(zhì)棕染和(或)胞核棕染，Ki-67陽(yáng)性定義為胞核紅染。如在同一細(xì)胞中同時(shí)出現(xiàn)胞質(zhì)棕染和胞核紅染，無(wú)論染色深度高低和表達(dá)水平強(qiáng)弱，均視為p16/Ki-67陽(yáng)性[10-11]。

1.2.4TCT檢測(cè) TCT采用ThinPrep 2000制片機(jī)(北京豪洛捷公司)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果以Bethesda系統(tǒng)為依據(jù)，分為無(wú)上皮內(nèi)病變或惡性病變(NILM)、意義不明的不典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)、非典型鱗狀細(xì)胞、不除外高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變、不典型腺細(xì)胞、低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、HSIL、鱗癌、原位腺癌和腺癌。本研究將TCT判讀結(jié)果ASCUS以下者定義為TCT結(jié)果陰性，ASCUS及以上者為陽(yáng)性。

1.2.5陰道鏡下宮頸活檢 受試者在p16/Ki-67細(xì)胞雙染、TCT采樣后1個(gè)月內(nèi)，由高級(jí)職稱同一醫(yī)生進(jìn)行陰道鏡檢查。3%醋酸和1%復(fù)方碘液涂抹宮頸，可疑病灶取活檢，如無(wú)明顯可疑病灶，取3、6、9、12點(diǎn)活檢，轉(zhuǎn)化區(qū)暴露不滿意者行宮頸管搔刮術(shù)。病理結(jié)果也由2名高級(jí)職稱病理醫(yī)生進(jìn)行判讀。結(jié)果分為：慢性炎或見挖空細(xì)胞、LSIL(CIN 1)、HSIL(CIN2～3)及以上。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 共有297例具有完整資料的患者納入本研究，年齡29～67歲，平均(48.87±7.68)歲。組織病理學(xué)結(jié)果顯示，慢性炎或見挖空細(xì)胞占總例數(shù)的56.90%(169/297)；LSIL患者占26.26%(78/297)；HSIL及以上者占16.84%(50/297)，其中鱗癌2例。p16/Ki-67細(xì)胞雙染總陽(yáng)性率為32.66%(97/297)。TCT提示ASCUS及以上者占21.55%(64/297)。見表1。

2.2不同病理結(jié)果中p16/Ki-67的陽(yáng)性率 慢性炎或見挖空細(xì)胞中p16/Ki-67的陽(yáng)性率為9.47%(16/169)；LSIL陽(yáng)性率為41.03%(32/78)；HSIL及以上陽(yáng)性率為94.00%(47/50)，其中鱗癌陽(yáng)性率為100.00%(2/2)。組織病理學(xué)結(jié)果HSIL及以上：p16/Ki-67雙染的靈敏度為98.00%，特異度為80.56%，陽(yáng)性似然比為5.16，陰性似然比為0.02。根據(jù)p16/Ki-67細(xì)胞雙染檢測(cè)結(jié)果繪制ROC曲線，p16/Ki-67細(xì)胞雙染的ROC曲線下面積為0.905(95%CI：0.872～0.978)。見表1。

2.3不同病理結(jié)果中TCT的陽(yáng)性率 本研究中，TCT結(jié)果ASCUS及以上者為11.78%(35/297)。組織病理學(xué)診斷結(jié)果HSIL及以上：TCT的靈敏度為70.00%，特異度為88.23%，陽(yáng)性似然比為5.80，陰性似然比為0.34。繪制ROC曲線，TCT的曲線下面積為0.850(95%CI：0.772～0.928)。

2.4p16/Ki-67細(xì)胞雙染與TCT比較 p16/Ki-67細(xì)胞雙染的靈敏度和特異度均較高，且靈敏度高于TCT。p16/Ki-67細(xì)胞雙染曲線下面積較TCT大(0.905>0.850)，p16/Ki-67細(xì)胞雙染與TCT在HSIL的檢測(cè)陽(yáng)性率進(jìn)行比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.583，P<0.001)。見表1。

表1 p16/Ki-67細(xì)胞雙染和TCT在不同組織病理學(xué)結(jié)果中的表達(dá)(n)

續(xù)表1 p16/Ki-67細(xì)胞雙染和TCT在不同組織病理學(xué)結(jié)果中的表達(dá)(n)

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)99%的宮頸癌是由HR-HPV持續(xù)感染所致[12]。生物學(xué)標(biāo)志物在當(dāng)今臨床研究中扮演著越來(lái)越重要的作用，p16的半衰期較短，具有細(xì)胞周期素依賴性，在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要的抑癌作用。相關(guān)研究顯示，在宮頸癌形成過(guò)程中，E7作為HPV的癌蛋白，也是確立和維持惡性表型的必要因素，由于E7介導(dǎo)的PRb功能性失活，導(dǎo)致p16水平過(guò)度表達(dá)[13]。因此，p16被認(rèn)為是HPV感染的替代性標(biāo)志物，與HR-HPV的致癌活性具有直接相關(guān)性。

Ki-67是一種核內(nèi)蛋白，與細(xì)胞分裂增殖具有直接相關(guān)性，其相對(duì)表達(dá)水平可在一定程度上反映細(xì)胞增殖活躍程度。研究表明，在Ki-67表達(dá)于G0期以外的所有細(xì)胞周期中，過(guò)度表達(dá)p16的細(xì)胞只有在細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制受損后才會(huì)活躍增殖，在正常生理?xiàng)l件下，同一細(xì)胞內(nèi)不能同時(shí)表達(dá)Ki-67和p16[14]。因此，細(xì)胞內(nèi)同時(shí)表達(dá)Ki-67和p16可作為細(xì)胞周期調(diào)控失常的標(biāo)志，當(dāng)雙染陽(yáng)性出現(xiàn)時(shí)，則意味著可能出現(xiàn)HSIL。由于 p16/Ki-67細(xì)胞雙染的理論基礎(chǔ)在于抗體與抗原的特異性結(jié)合,具有可重復(fù)性和客觀性，不易被主觀因素所影響，因此，有助于取得更加客觀的診斷結(jié)果[15]。

本研究中，p16/Ki-67細(xì)胞雙染陽(yáng)性率隨著病理結(jié)果異常度的升高而升高，這與其他相關(guān)研究結(jié)論一致[16-17]。p16/Ki-67細(xì)胞雙染和TCT的ROC曲線下面積分別為0.905(95%CI：0.872～0.978)及0.850(95%CI：0.772～0.928)。p16/Ki-67細(xì)胞雙染的曲線下面積較TCT大(0.905>0.850)。研究結(jié)果顯示，針對(duì)HSIL檢測(cè)而言，p16/Ki-67細(xì)胞雙染HSIL檢測(cè)陽(yáng)性率優(yōu)于TCT。兩者進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，p16/Ki-67雙染與TCT比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.583，P<0.001)。這一結(jié)果與廖光東等[18]對(duì)62例HR-HPV陽(yáng)性婦女進(jìn)行p16/Ki-67細(xì)胞雙染預(yù)測(cè)宮頸病變的報(bào)道相一致。

本研究中病理結(jié)果HSIL及以上者TCT的靈敏度為70.00%，特異度為88.23%，與相關(guān)研究提示TCT客觀性較差，假陰性率、假陽(yáng)性率為5%～50%的結(jié)果并不一致[19]。究其原因，可能與本次試驗(yàn)樣本量較小及TCT檢查結(jié)果判讀的主觀因素有關(guān)。

此外，研究發(fā)現(xiàn)，p16/Ki-67細(xì)胞雙染及TCT陽(yáng)性似然比分別為5.16、5.80，陰性似然分別比0.02、0.34。研究結(jié)果提示，p16/Ki-67細(xì)胞雙染對(duì)HISL的陰性預(yù)測(cè)價(jià)值優(yōu)于TCT。該結(jié)果與吳憂等[20]對(duì)251例細(xì)胞學(xué)診斷為ASCUS及以上的患者進(jìn)行p16/Ki-67細(xì)胞雙染的結(jié)論一致。

臨床上對(duì)HSIL初篩主要采取TCT和HR-HPV檢測(cè)，2種技術(shù)在診斷靈敏度和特異度方面均存在一定的不足。而本研究采用的p16/Ki-67細(xì)胞雙染診斷HSIL具有較高的靈敏度和特異度。因此，在臨床實(shí)踐中，可以考慮選取HR-HPV聯(lián)合p16/Ki-67細(xì)胞雙染進(jìn)行宮頸癌初篩，以盡可能減少漏診及診治過(guò)度。