IBD患病人群腸道菌群分布特征及其與血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平的關系

李冬盎，馬曉芬，曲湉湉，李 歡

海軍第九七一醫院檢驗科，山東青島 266102

炎癥性腸病(IBD)是一組包括潰瘍性結腸炎(UC)、克羅恩病(CD)在內的腸道慢性炎癥性疾病，患者主要臨床表現為反復發作的腹脹、腹痛、腹瀉、大便異常(黏液稀便、黏液膿便、膿血便、血水樣便等)及發熱，部分患者還會出現關節炎、皮疹等各種腸外表現[1]。當前，我國IBD患者數量不斷增加，發病率逐漸升高，嚴重影響患者的生活質量。IBD的病因目前尚不清楚，絕大多數學者認為其可能與遺傳、免疫、環境、腸道微生態等因素密切相關，尤其是腸道微生態紊亂的臨床表現及相關作用機制逐漸受到越來越多學者的關注[2-3]。無論是國內還是國外都建議在治療IBD時根據患者整體病情變化，尤其是病變累及部位和病情嚴重程度采用個體化治療方案，但目前臨床上所應用的評估患者疾病活動性的治療均存在一定局限性[4]。免疫炎癥相關蛋白復合物(IIRPCs)是存在于人體血清中的一種與機體炎癥、免疫和補體系統有關的蛋白質，參與機體系統發現、細菌清除及腸道免疫的穩態[5]。髓過氧化酶(MPO)是一類存在于中性粒細胞中與細胞浸潤程度有關的酶，在評價組織中性粒細胞的浸潤程度和炎癥發生方面發揮著重要作用。研究發現，MPO活性變化能通過對中性粒細胞浸潤情況的調節來改變結腸炎患者炎性反應情況和臨床癥狀，可用于結腸炎等感染性疾病、腸道有關疾病的診斷、病情評估、治療效果及預后評價[6]。維生素D1-α羥化酶(CYP27B1)是循環形式維生素D轉化為有活性的1,25二羥基維生素D3(1,25-OH2-D3)過程中的關鍵酶，而維生素D的缺乏也被指出與免疫相關疾病發生、發展有關，這其中就包括IBD[7]。本文探討IBD患病人群腸道菌群分布特征與血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平的變化，并進一步對二者的相關性進行分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年7月至2020年4月在本院消化科門診和住院治療的106例IBD患者作為病例組，其中UC患者58例作為UC組，CD患者48例作為CD組；選取同期在本院接受治療的60例非IBD腸道疾病患者作為疾病對照組；另選取在本院同期進行結腸鏡檢查的60例體檢健康者作為健康對照組。病例組納入標準：(1)符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見(2012，廣州)》的診斷標準[8]；(2)年齡18～60周歲；(3)經臨床表現、影像學檢查、組織病理檢查、內鏡檢查、實驗室檢查等均確診。病例組排除標準：(1)近期患有上消化道糜爛、潰瘍或感染性胃腸病；(2)30 d內服用非甾體類抗炎藥、益生菌制劑、他汀類、維生素D制劑等藥物；(3)合并免疫系統相關疾病；(4)合并嚴重肝腎功能障礙、原發性甲狀腺功能亢進等可能引起嚴重維生素D代謝紊亂的相關疾病；(5)有腸道手術史；(6)無法行全結腸鏡檢查。疾病對照組患者就診時均表現出不同程度的腹痛、發熱、腹瀉等，經結腸鏡檢查排除IBD。健康對照組研究對象均經病史詢問和體格檢查無消化道相關疾病，無自身免疫病史、其他系統惡性腫瘤病史，近期未使用可能影響本研究結果的相關藥物。病例組中男72例，女34例；年齡20～58歲，平均(42.29±5.93)歲；其中緩解期組32例，活動期組74例，活動期組包括輕度活動期組21例，中度活動期組32例，重度活動期組21例。疾病對照組中男43例，女17例；年齡18～60歲，平均(41.06±7.92)歲；其中小腸炎癥16例，小腸潰瘍19例，慢性結腸炎20例，結腸癌5例。健康對照組中男41例，女19例；年齡18～56歲，平均(40.94±7.15)歲。各組研究對象年齡、性別等一般資料比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫院倫理委員會審核通過，患者和(或)家屬均知情，并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1資料收集 收集所有研究對象的相關臨床資料，包括基本信息、診斷、疾病活動性評估、實驗室檢查結果、結腸鏡檢查結果等。UC患者疾病活動性評估應用改良Mayo評分評價[9]，評分≤2分且每個單項評分均超過1分為緩解期，否則為活動期，其中>2～5分為輕度活動期，>5～10分為中度活動期，>10～12分為重度活動期。CD患者疾病活動性評估應用Harvey-Bradshaw指數評價[10]，評分≤4分為緩解期，>4分為活動期，其中>4～8分為中度活動期，>8分為重度活動期。

1.2.2標本采集與儲存 采集所有受試者結腸鏡檢查當天的空腹血液標本和新鮮糞便標本5～10 g，血液標本于4 ℃下3 000 r/min離心10 min后采集上層血清，置于-80 ℃冰箱中保存待測；新鮮糞便標本置于無菌密閉的便盒中，常溫下0.5 h內送檢。

1.2.3血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平檢測 取保存的血清標本，應用Native-PAGE電泳方法進行血清蛋白電泳，以人血清轉鐵蛋白相關蛋白復合物水平對IIRPCs、CYP27B1水平進行相對定量，應用Umax Powerlook 2100XL Scanner凝膠掃描儀進行凝膠掃描，應用美國Bio-Rad公司的Quantity One 軟件計算標本中的IIRPCs和CYP27B1的水平；采用乳膠增強免疫比濁法檢測血清MPO水平，在日立7180全自動生化分析儀上進行檢測，MPO試劑盒購自北京九強生物科技有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

1.2.4腸道菌群檢測 取0.5 g新鮮糞便標本，10倍法稀釋。選擇腸球菌、腸桿菌、消化球菌、擬桿菌、酵母菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌、真桿菌進行培養、鑒定和檢測，選擇相應的培養基進行培養。采用需氧培養基培養腸球菌、腸桿菌和酵母菌，采用厭氧菌培養基對其他細菌進行培養，培養溫度均為37 ℃，時間分別為24 h和72 h。細菌鑒定應用法國生物梅里埃公司的半自動微生物鑒定系統，用每克糞便中含有菌數的log CFU/g表示菌落數量。

2 結 果

2.1各組研究對象腸道菌群數量比較 UC、CD組患者的腸道腸球菌、腸桿菌、消化球菌、擬桿菌、酵母菌數量較健康對照組和疾病對照組均明顯增加，而乳酸桿菌、雙歧桿菌、真桿菌則明顯減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。UC組和CD組腸道各菌群數量比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。106例IBD患者中，緩解期與活動期患者上述腸道菌群數量比較，差異有統計學意義(P<0.05)。重度活動期患者與輕度、中度活動期患者比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，輕度活動期患者與中度活動期患者比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1、2。

表1 UC組、CD組、健康對照組、疾病對照組腸道菌群數量比較

表2 IBD患者緩解期組、輕度活動組、中度活動組、重度活動組腸道菌群數量比較

2.2各組研究對象血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比較 UC、CD組血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平均明顯高于健康對照組和疾病對照組(P<0.05)。UC組與CU組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。106例IBD患者中，緩解期與活動期IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；重度活動期患者與輕度、中度活動期患者血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比較，差異有統計學意義(P<0.05)；輕度活動期組患者與中度活動期組患者比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3、4。

表3 UC組、CD組、健康對照組、疾病對照組血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比較

表4 IBD患者緩解期組、輕度活動組、中度活動組、重度活動組血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比較

2.3IBD患者腸道菌群數量與血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平的相關性分析 Pearson相關性分析顯示，IBD患者的血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平與腸道腸球菌、腸桿菌、擬桿菌、酵母菌數量呈正相關(P<0.05)，與乳酸桿菌、雙歧桿菌數量呈負相關(P<0.05)，與真桿菌和消化球菌數量無相關性(P>0.05)。見表5。

表5 IBD患者腸道菌群數量與血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平的相關性分析

3 討 論

腸道菌群是IBD發病機制研究的一個重要內容。研究指出，人體的腸道中含有數量巨大的可影響腸黏膜免疫系統功能的細菌，其能使有IBD遺傳易感性個體的腸道免疫反應發生異常，進而可能誘發IBD[2]。腸道菌群包含中性菌、有害菌和益生菌，是人體腸道微生態的重要組成部分。不同菌群在正常生理條件下處于一個平衡狀態，互相依存和制約，發揮其生物屏障作用。而一旦這種平衡被打破，腸道菌群處于紊亂狀態時，就會引起腸道功能異常，繼而引發疾病。IBD的發病中，腸道菌群成分的存在不可或缺。有研究對對照組、UC組和CD組的腸道菌群分布情況進行觀察發現，UC、CD患者腸道雙歧桿菌數量顯著減少，消化球菌、真桿菌明顯增加[11]。本研究結果顯示，UC、CD組患者的腸道腸球菌、腸桿菌、消化球菌、擬桿菌、酵母菌數量較健康對照組和疾病對照組均明顯增加，而乳酸桿菌、雙歧桿菌、真桿菌則明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)；UC組和CD組腸道各菌群數量比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示IBD患者存在明顯的腸道菌群失調，表現出以乳酸桿菌、雙歧桿菌為代表的益生菌數量的減少和以腸球菌、腸桿菌等為代表的條件致病菌數量的增加。進一步比較不同疾病活動性患者的腸道菌群分布顯示，緩解期與活動期患者上述腸道菌群數量比較也存在明顯差異，其中重度活動期患者與輕度、中度活動期患者比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，輕度活動期患者與中度活動期患者比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示與其他非IBD腸道疾病患者和健康人群比較，IBD患者存在明顯的的腸道微生態失衡，且與其疾病活動性密切相關。腸道微生態紊亂會降低拮抗病原微生物的定植抵抗力，腸道免疫系統無法耐受這種菌群的變化，導致腸黏膜屏障功能受損和腸道通透性改變，位于腸腔中的細菌和產物轉移至腸黏膜固有層，黏膜免疫被激活，人體對自身腸腔中的細菌和產物失去耐受，進而導致IBD的發生[12]。

IBD存在很多細胞介導免疫反應異常的現象，包括T淋巴細胞亞群改變和黏膜IgG產生細胞，說明黏膜免疫細胞在收到抗原刺激后聚集和被激活，尤其以輔助性T細胞激活顯著，進而引起各種細胞因子分泌和釋放，使黏膜炎癥產生和加重，導致IBD相關的病理改變。血清中的IIRPCs是很多炎癥相關蛋白分子通過非共價鍵互相作用形成的一包含補體、免疫球蛋白、轉鐵蛋白、載脂蛋白、觸珠蛋白等的蛋白復合物，其與人體的補體、炎癥和免疫系統等密切相關。補體系統不僅能幫助機體發現和清除細菌，還有助于維持腸道免疫系統處于穩定的狀態。有關兒童IBD的一項研究顯示，補體C4水平與患兒炎癥水平呈正相關，補體系統對微生物反應程度的增強是導致IBD患者腸道微生態菌群失調的原因之一[13]。MPO是髓細胞的特異性標志物，存在于髓系細胞的嗜苯胺藍顆粒中，是中性細胞衍生蛋白，當機體受到感染、炎癥等刺激時，中性粒細胞及單核細胞就會釋放大量的MPO，MPO能將活化信號通過細胞信號通路傳遞到細胞核內，使機體炎性反應程度增強，并決定細胞浸潤情況。MPO在很多感染性疾病的篩查、診斷、病情評估、治療效果監測與評價中發揮著重要作用。此外，還有學者指出，MPO產生的自由基對小鼠腸道抗氧化能力、炎性反應和腸道菌群結構均會產生影響，其會通過不同作用參與到腸道菌群的調控中[14]。糞便中MPO的檢測對IBD的診斷具有較高的輔助臨床價值，其存在穩定且易于檢測，能較好地反映患者腸道局部病變情況和疾病活動性。有學者研究指出，血清MPO對IBD的輔助診斷也有一定的應用價值，相比糞便標本，血清標本能更好地反映出患者全身的整體情況，但在特異性判斷疾病活動性上可能有一定局限性[15]。CYP27B1是將循環形式維生素D轉化為有活性的1,25-OH2-D3過程的關鍵酶，也是維生素D的生物作用形式。研究指出，腸道炎性反應組織中CYP27B1水平會顯著升高，其會通過調節循環中的維生素D水平來參與IBD的發生、發展[16]。腸道外周組織和免疫細胞(樹突狀細胞、巨噬細胞等)中均可見CYP27B1的表達。CYP27B1對結腸黏膜有保護作用，其能通過維持局部組織的維生素D來參與機體的抗炎反應。而維生素D已經被證實能影響機體腸道屏障結構、功能及微生物組成，從而影響腸黏膜和腸道菌群的穩定性[17]。本研究結果顯示，UC、CD組血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平均明顯高于健康對照組和疾病對照組，緩解期與活動期，以及重度活動期與輕度、中度活動期患者血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，輕度活動期患者與中度活動期患者比較，差異無統計學意義(P>0.05)。相關性分析顯示，IBD患者的血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平與腸道腸球菌、腸桿菌、擬桿菌、酵母菌數量呈正相關(P<0.05)，與乳酸桿菌、雙歧桿菌數量呈負相關(P<0.05)，提示與其他非IBD腸道疾病患者和健康人群比較，IBD患者血清IIRPCs、MPO、CYP27B1水平均明顯升高，其表達與患者疾病活動性有關，而且與腸道菌群也存在一定相關性，血清IIRPCs、MPO、CYP27B1可作為無創性生物標志物用于IBD患者與非IBD腸道疾病患者鑒別診斷及IBD患者病情活動性的評估。但其在IBD發生、發展和患者腸道菌群紊亂中的具體作用和機制還需進一步研究證實。